豬PMAP-23單克隆抗體的制備及乳鐵蛋白對PMAP-23分泌表達的影響.pdf

1、本研究利用豬抗菌肽PMAP-23的氨基酸片段,應用雜交瘤技術成功制備了抗天然抗菌肽PMAP-23單克隆抗體。然后利用制備的單克隆抗體建立抑制酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測方法,在翻譯水平上研究了乳鐵蛋白對豬抗菌肽PMAP-23基因分泌表達的影響。主要研究結果如下:
　　 1.利用碳化二亞胺法將人工合成的PMAP-23(RIIDLLWRVRRPQKPKFVTVWVR)的氨基酸片段與卵清蛋白(OVA)和牛血清白蛋白(BSA)偶聯

2、制備人工免疫原PMAP-23-OVA和包被原PMAP-23-BSA,應用雜交瘤技術成功制備了兩株能穩(wěn)定分泌PMAP-23單克隆抗體的雜交瘤細胞株2E4和3C1。將獲得的陽性雜交瘤細胞株擴大培養(yǎng),通過腹腔注射注入BALB/C小鼠體內,制備PMAP-23的單克隆抗體腹水,并應用辛酸-硫酸銨鹽析法純化腹水得到純度較高的單克隆抗體。
　　 2.對純化的單克隆抗體進行相關性質初步鑒定。試驗結果發(fā)現,骨髓細胞培養(yǎng)上清對PMAP-23單克隆抗

3、體具有明顯的抑制效果,說明PMAP-23是豬骨髓源性抗菌肽,且制備的PMAP-23單克隆抗體是天然抗菌肽PMAP-23的單克隆抗體;所得單克隆抗體濃度高于10.0 mg/mL;間接ELISA測定其效價在1:2.5×105以上;其中2E4細胞株分泌的單克隆抗體效價更高,其最佳工作濃度為稀釋4.1×105倍;制備的單克隆抗體特異性強,與其他抗菌肽無交叉反應;雙向瓊脂擴散試驗測得制備的單克隆抗體為IgG1亞類。
　　 3.本試驗利用制

4、備的抗菌肽PMAP-23單克隆抗體和雜交瘤技術篩選并建立了3株能分泌抗菌肽PMAP-23的細胞株,分別命名為1E7、282和285。該細胞株培養(yǎng)上清中抗菌肽PMAP-23的含量與對照組小鼠骨髓瘤細胞培養(yǎng)上清中抗菌肽含量相比,差異均極顯著(P＜0.01)。該細胞株的建立為抗菌肽PMAP-23相關性質的研究奠定了基礎。同時,本試驗的研究方法和思路也為其他小分子肽類物質的研究奠定了基礎。
　　 4.從30日齡斷奶杜長大仔豬的股骨抽取并

5、分離骨髓細胞,進行體外培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)48 h后,分別以10μg/mL、100μg/mL、1000μg/mL的乳鐵蛋白處理細胞,空白對照孔用等量的RPMI1640培養(yǎng)液代替,繼續(xù)培養(yǎng)3 h,6 h,12 h和24 h,每個時間點每個試驗孔設3個重復。將每個試驗孔的細胞培養(yǎng)液離心取上清,應用制備的PMAP-23特異性單克隆抗體建立抑制ELISA,在翻譯水平上研究不同濃度乳鐵蛋白不同作用時間對豬抗菌肽PMAP-23基因分泌表達的影響。結果表明