豬血液中抗菌肽成熟肽pMAP-23與pG-2基因的克隆及原核表達.pdf

1、抗菌肽是一類廣泛存在于生物體內的小分子多肽，具有廣譜抗菌，理化性質穩(wěn)定等特性，是生物體自身防御系統(tǒng)的一部分。原核生物、植物、動物(包括無脊椎動物和非脊椎動物)都可以產(chǎn)生由基因編碼、核糖體合成的抗菌肽。由于抗菌肽分子的兩親性結構和正電荷可使其在細菌細胞質膜上穿孔而形成離子孔道，造成細菌細胞質膜結構破壞，引起胞內水溶性物質大量滲出，而最終導致細菌死亡。這種獨特的抗菌機制不會使病原微生物菌株變異而產(chǎn)生抗藥性，而且對機體無毒副作用，這將為解決細

2、菌對青霉素等傳統(tǒng)抗生素日益增強的耐藥性及藥物殘留這兩大棘手的難題提供新途徑。更為重要的是抗菌肽對真核細胞幾乎沒有作用，僅作用于原核細胞和發(fā)生病變的真核細胞，因而具有重要的開發(fā)應用前景。目前，為了降低畜禽體內藥物殘留，提高動物性食品安全性，現(xiàn)對畜禽體內自然產(chǎn)生的抗菌肽的功能進行了解并設計一種方法來調節(jié)動物體內自然抗菌肽的功能便顯得極為重要，其中通過基因工程手段誘導表達抗菌肽，以及改造合成抗菌肽基因工程，已越來越受到人們的重視。

3、PMAP-23與PG-2是豬血液中兩種抗菌肽。PMAP-23與PG-2屬于Cathelicidins家族，起源于骨髓細胞，組成性的以前肽(Propeptides)形式儲存在周邊PMNs(多形核嗜中性白細胞)顆粒中。當PMNs激活和脫顆粒時，內源性彈性蛋白酶把成熟肽從前肽中切割出來。PMAP-23成熟肽由23個氨基酸殘基組成，呈發(fā)卡結構。PMAP-23抗G+(革蘭氏陽性菌)和G-(革蘭氏陰性菌)。PG-2成熟肽由16個氨基酸殘基組成，不僅

4、對G+和G-有作用，同時也抗真菌(F)和囊膜病毒(V)，PG-2的抗微生物活性保持在生理NaCl濃度，不受細胞外陽離子或血清成分抑制。 1.pMAP-23與pG-2基因的克隆 本試驗從生豬骨髓中提取總的RNA，并根據(jù)Gen Bank中收錄的豬源抗菌肽PIGPMAP23P與PIGLAP的成熟肽pMAP-23與pG-2基因設計引物。通過RT-PCR得到pMAP-23與pG-2基因，純化并與克隆載體pMD18-T相連，通過雙酶

5、切做初步的鑒定，酶切成功，再經(jīng)測序鑒定。序列分析結果表明PIGPMAP23P的成熟肽pMAP-23基因全長426bp與Gen Bank中報道序列有兩個堿基發(fā)生突變，但氨基酸沒有突變，PIGLAP的成熟肽pG-2基因全長362bp與Gen Bank中報道的序列完全相同，基因無突變，見附表。 2.pMAP-23與pG-2基因的原核表達 將pMAP-23與pG-2基因陽性克隆產(chǎn)物酶切回收目的片段，與制備好的pET-28a空載體

6、相連。再經(jīng)雙酶切鑒定，連接成功后，將pET-28a-pMAP-23與pET-28a-pG-2的陽性質粒轉入到大腸桿菌BL21感受態(tài)，經(jīng)30℃、4小時的IPTG誘導，SDS-PAGE電泳鑒定。結果表明，pMAP-23基因誘導出大于18KDa的融合蛋白，pG-2基因誘導出略大于18KDa融合蛋白。再經(jīng)0-7小時，30℃誘導，塞選出最佳誘導時間是5-6小時。 本實驗研究成果可以為針對豬只常見病的病原微生物的體外實驗提供實驗依據(jù)。體外實