豬乳鐵蛋白的分離純化及其在巴斯德畢赤酵母中的分泌表達(dá).pdf

1、乳鐵蛋白(Lactoferrin，簡稱LF)是一種多功能的糖蛋白，主要存在于哺乳動(dòng)物的乳汁、眼淚等外分泌物中，乳汁尤其是初乳中LF的含量最高．LF不僅具有廣譜的抗菌和抗病毒的作用，而且還能夠增強(qiáng)機(jī)體抗感染、抗腫瘤和免疫能力。 通過30％飽和硫酸銨沉淀、50％飽和硫酸銨沉淀，85％飽和硫酸銨沉淀--三步沉淀法和一步肝素瓊脂糖親和柱親和層析進(jìn)行天然豬乳鐵蛋白的分離純化，SDS-PAGE分析表明，獲得的豬乳鐵蛋白的相對分子量為80kD

2、a。分別用制備的天然豬乳鐵蛋白免疫雞和兔子，制備高免血清，建立了測定豬乳鐵蛋白的雙夾心酶聯(lián)免疫法(EIISA)，并將該法運(yùn)用于分離純化天然豬乳鐵蛋白各步驟，計(jì)算出了豬乳鐵蛋白最終得率與純度：65.6％，91％。Pichia pastoris表達(dá)系統(tǒng)是近年來迅速發(fā)展起來的一種真核表達(dá)系統(tǒng)。Pichia pastoris是一種甲醇酵母，可以在以甲醇為唯一碳源和能源的培養(yǎng)基中生長。在表達(dá)外源蛋白時(shí)，不僅具有原核生物生長快、操作簡便、成本低的特

3、點(diǎn)，而且具備哺乳動(dòng)物的翻譯后加工修飾的功能，從而表達(dá)出有生物活性的外源蛋白。 應(yīng)用RT-PCR方法獲得小型豬乳鐵蛋白(pLF)基因，將其插入到pMD19-T simple載體中，構(gòu)建克隆載體pMD- pLF?？寺〉膒LF基因片段全長2102bp，與GenBank上豬乳鐵蛋白序列(登錄號：L77887)的同源性達(dá)99％以上．對克載體pMD-pLF進(jìn)行雙酶切，將得到的2102bp長的pLF基因片段以正確的閱讀框架定向克隆入含乙醇氧化

4、酶啟動(dòng)子和分泌信號肽序列的Pichia pastoris表達(dá)載體pPICZaA中。通過電擊法將經(jīng)SacI酶切線性化的pPICZaA-pLF轉(zhuǎn)化到畢赤酵母菌株GS115中，經(jīng)Zeocin抗性濃度梯度篩選獲得高抗性重組菌株，0.5％甲醇誘導(dǎo)表達(dá)．表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)TCA/DOC濃縮后進(jìn)行SDS-PAGE和Western-blot鑒定。結(jié)果顯示，分泌于胞外的重組蛋白的分子量約為80kDa，與天然豬乳鐵蛋白的分子量基本一致。Western-blot結(jié)果