巖藻糖化寡糖Lewis Y抗原及其合酶FUT4的表達(dá)與胃癌幽門螺桿菌相關(guān)性的研究.pdf

1、Ⅰ.背景
　　胃癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，在癌癥相關(guān)的疾病中，胃癌是導(dǎo)致男性死亡的第三大死因;也是女性死亡的第五大原因。胃癌在發(fā)展中國家中高發(fā)，占世界發(fā)病率的三分之二，這些國家包括日本，中國，南美，東歐，以及中東地區(qū)等。在中國，胃癌的發(fā)病率較高，占全世界的所有胃癌病例的42％。幽門螺桿菌(H.pylori)是導(dǎo)致慢性胃炎、胃潰瘍和胃癌的主要因素之一。H.pylori屬于革蘭氏陰性需氧菌，屬于螺旋形桿菌有鞭毛結(jié)構(gòu)。世界上50％

2、以上的人口有幽門螺旋桿菌感染，但是由感染引起的胃癌發(fā)病率較低。在發(fā)展中國家，80％的人口被感染，而發(fā)達(dá)國家的感染率為20-50％。幽門螺旋桿菌細(xì)胞毒素相關(guān)抗原A(H.pyloricytotoxinassociatedantigenA，CagA)是細(xì)菌的癌蛋白，在胃癌的發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。CagA的分子量是128kDa，由幽門螺旋桿菌的40kb的CAG-致病島(cag-pathogenicityisland，cagPAI)所編碼。Cag

3、A是由Ⅳ型分泌系統(tǒng)分泌，在進(jìn)入胃上皮細(xì)胞之后，發(fā)生磷酸化反應(yīng)，通過促進(jìn)細(xì)胞散射而導(dǎo)致幽門螺旋桿菌相關(guān)的疾病的發(fā)生。
　　某些糖鏈在胃癌細(xì)胞表面異常表達(dá)，如ABH血型抗原和Lewis相關(guān)糖抗原等。巖藻糖是的糖鏈的重要成分之一，參與合成一些重要的生長因子受體，在胃癌發(fā)展的過程中發(fā)揮重要作用。巖藻糖基化在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中有重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，巖藻糖基化反應(yīng)在許多癌癥中，如乳腺癌、前列腺癌、肺癌和胃癌異常增高。巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶Ⅳ(fuc

4、osyltransferaseⅣ，F(xiàn)UT4)是路易斯Y(LewisY，LeY)合成的關(guān)鍵酶。LeY是雙巖藻糖化的寡糖，在60-90％的上皮來源的癌癥中高表達(dá)。表皮生長因子受體（epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR）的糖基化反應(yīng)在腫瘤細(xì)胞增殖的過程中起著重要的作用。幽門螺旋桿菌感染后，能抑制EGFR的活化，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖，分化和凋亡。
　　由于缺乏特異的診斷指標(biāo)和有效的治療手段導(dǎo)致胃癌具有高的死亡率。

5、在中國，胃癌的發(fā)病率很高，是癌癥死亡的首要原因。盡管近年來胃癌的治療方法改進(jìn)，但仍然有較高的轉(zhuǎn)移率和死亡率。因此，發(fā)現(xiàn)新的生物標(biāo)記物對于診斷和治療幽門螺旋桿菌感染及預(yù)防胃癌具有重大的意義。塞來昔布(Celecoxib)是環(huán)氧化酶2(Cyclooxygenase2，COX-2)抑制劑，可以通過下調(diào)的環(huán)氧化酶-2(COX-2)的表達(dá)抑制胃癌細(xì)胞的增殖。COX-2的在不同類型的癌癥（包括胃癌）高表達(dá)。在胃癌中，Hpylori通過增加COX-2

6、的表達(dá)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡。但是塞來昔布的治療效果差，這限制了塞來昔布在臨床的應(yīng)用性。因此，制定更好的策略來提高塞來昔布的療效有重要的臨床意義。LeY寡糖抗體在臨床上廣泛應(yīng)用來治療不同類型的癌癥。因此，聯(lián)合使用塞來昔布和LeY寡糖抗體可能有效地治療胃癌。
　　人參皂苷(Ginsenoside，Rg3)是中國草藥，能抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。SP1和HSF1是FUT4的轉(zhuǎn)錄因子，在LeY寡糖合成調(diào)解過程中發(fā)揮重要作用。前期研究發(fā)

7、現(xiàn)，Rg3通過SP1和HSF1下調(diào)FUT4的表達(dá)，從而誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞的凋亡。而CagA與巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶在胃癌中的相互關(guān)系尚未明確。在本文中，我們分析CagA與巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的相關(guān)作用及其作用機(jī)制。此外，討論聯(lián)合塞來考昔、LeY寡糖抗體和Rg3在細(xì)胞增殖和凋亡中的治療效果。
　?、?目的
　　1.我們通過對胃炎，胃潰瘍和胃癌組織和血清樣品分析討論CagA與EGFR的激活、FUT4和LeY寡糖之間的內(nèi)在聯(lián)系。此外，研究H.pylo

8、ri中CagA促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖的作用機(jī)制。
　　2.我們在胃癌患者的組織和血清樣品中研究H.pylori與COX-2及胃癌診斷標(biāo)記物（CA724，和GRN）的相關(guān)性;及聯(lián)合使用塞來昔布和LeY寡糖抗體對胃癌細(xì)胞增殖的抑制作用。
　　3.討論Rg3治療胃癌的作用機(jī)制。
　?、?實(shí)驗(yàn)方法
　　1.我們運(yùn)用免疫組化分析胃炎，胃潰瘍和胃癌組織和血清樣品中CagA與pEGFR、FUT4、COX-2、CA724、GRN及H.

9、pylori的相關(guān)性。
　　2.我們運(yùn)用ELISA分析胃炎，胃潰瘍和胃癌組織和血清樣品中CagA與pEGFR、FUT4、COX-2、CA724、GRN及H.pylori的相關(guān)性。
　　3.利用人胃癌細(xì)胞株（SGC-7901）進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，通過WesternBlot研究CagA對細(xì)胞增殖的影響。
　　4.我們通過免疫染色分析在SGC-7901細(xì)胞中CagA對細(xì)胞增殖的影響。
　　5.我們通過ELISA討論在SGC-

10、7901細(xì)胞中CagA對細(xì)胞增殖的影響。
　　6.我們通過流式細(xì)胞術(shù)研究在SGC-7901細(xì)胞中CagA對細(xì)胞增殖的影響。
　　7.我們鑒定并培養(yǎng)胃癌原代細(xì)胞，用塞來昔布、LeY寡糖抗體及聯(lián)合塞來昔布和LeY寡糖抗體處理細(xì)胞，通過WesternBlot檢測COX-2、CA724和GRN的表達(dá)。
　　8.我們通過ELISA分析COX-2、CA724和GRN的在胃癌原代培養(yǎng)的細(xì)胞中的表達(dá)變化。
　　9.我們通過流式細(xì)

11、胞術(shù)分析COX-2、CA724和GRN的在胃癌原代培養(yǎng)的細(xì)胞中的表達(dá)變化。
　　10.我們用Rg3(50μg/ml)處理胃癌細(xì)胞，通過WesternBlot檢測FUT4、SP1和HSF1的表達(dá)。
　　11.我們用Rg3(50μg/ml)處理胃癌細(xì)胞，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測FUT4、SP1和HSF1的表達(dá)。
　　12.我們用Rg3(50μg/ml)處理胃癌細(xì)胞，通過ELISA檢測FUT4、SP1和HSF1的表達(dá)。
　　

12、13.CCK-8檢測細(xì)胞增殖的能力。
　?、?實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　1.H.pylori和CagA對細(xì)胞增殖的影響機(jī)制的研究
　　(i)與胃炎，胃潰瘍的患者相比，胃癌組織和血清中CagA、p-EGFR、FUT4和LeY的表達(dá)增高。
　　(ii)在胃癌組織和血清中，CagA與p-EGFR、FUT4和LeY的表達(dá)相關(guān)。
　　(iii)CagA促進(jìn)細(xì)胞增殖并且呈劑量依賴性。
　　(iv)CagA上調(diào)PCNA的表達(dá)及

13、EGFR、ERK1/2和P38的磷酸化水平。
　　(v)CagA上調(diào)FUT4的表達(dá)并呈劑量依賴性。
　　(vi)CagA上調(diào)LeY、LeB、LeX和sLeX的表達(dá)。
　　2.塞來昔布和LeY寡糖抗體抑制細(xì)胞增殖的機(jī)制的研究
　　(i)與普通胃上皮細(xì)胞相比，胃癌細(xì)胞增殖能力強(qiáng)。
　　(ii)與胃炎，胃潰瘍的患者相比，胃癌組織和血清中H.pylori、COX-2、CA724和GRN的表達(dá)上調(diào)。
　　(ii

14、i)在胃癌中，H.pylori的表達(dá)和LeY、COX-2、CA724及GRN的表達(dá)相關(guān)。
　　(iv)塞來昔布抑制FUT1、FUT4和LeY的表達(dá)。
　　(v)LeY調(diào)節(jié)H.pylori的毒性。
　　(vi)聯(lián)合使用塞來昔布和LeY寡糖抗體處理細(xì)胞，能抑制胃癌細(xì)胞的增殖。
　　3.Rg3對胃癌細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制的研究
　　(i)Rg3通過激活caspase-3，-8，-9及PARP的裂解促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡。<

15、br>　　(ii)在胃癌細(xì)胞中，Rg3下調(diào)FUT4的表達(dá)。
　　(iii)CagA調(diào)節(jié)SP1和HSF1的表達(dá)。
　　(iv)Rg3調(diào)節(jié)SP1和HSF1的表達(dá)。
　　(v)SP1和HSF1調(diào)節(jié)FUT4的表達(dá)。
　　Ⅴ.結(jié)論
　　1.胃癌中CagA、pEGFR、FUT4和LeY的表達(dá)升高;CagA通過EGFR/MAPKs信號通路促進(jìn)FUT4和LeY的表達(dá)。
　　2.LeY抗體增加塞來昔布的抗腫瘤作用;Le