顳葉癲癇海馬區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞大麻素Ⅰ型受體的表達(dá)及功能研究.pdf

1、背景：
　　大麻素Ⅰ型受體(cannabinoid type1 receptor,CB1R)是一類廣泛表達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸前膜的G蛋白偶聯(lián)受體(G protein coupled receptor,GPCR),感受突觸后逆向分泌的內(nèi)源性大麻素(endogenous cannabinoid,EC),抑制神經(jīng)遞質(zhì)釋放,從而調(diào)控突觸傳遞乃至神經(jīng)元興奮性,在癲癇發(fā)生機(jī)制中發(fā)揮重要作用。但是目前關(guān)于CB1R在癲癇中的作用尚無統(tǒng)一的結(jié)論。有

2、研究報道CB1R激動劑可以抑制癲癇發(fā)作,但也有文獻(xiàn)報道CB1R激動劑可以促進(jìn)癲癇發(fā)作。這些矛盾的研究結(jié)果提示,很可能存在突觸以外尚未被發(fā)現(xiàn)的CB1R表達(dá),具有和突觸上CB1R不同的調(diào)控機(jī)制。最新報道提示,星形膠質(zhì)細(xì)胞(astrocyte,AST)上存在CB1R,并且在維持大鼠海馬癲癇樣放電中發(fā)揮重要作用。但星形膠質(zhì)細(xì)胞上的CB1R是否參與了慢性癲癇發(fā)生,特別是藥物難治性癲癇的發(fā)生機(jī)制,尚無明確結(jié)論。因此,我們對星形膠質(zhì)細(xì)胞上CB1R在顳

3、葉癲癇(temporal lobe epilepsy,TLE),一種常見的藥物難治性癲癇,的發(fā)生過程中的作用機(jī)制進(jìn)行探討。
　　目的：
　　觀察顳葉癲癇患者硬化海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞CB1R的表達(dá)特點,進(jìn)而明確顳葉癲癇發(fā)生過程中星形膠質(zhì)細(xì)胞CB1R時空表達(dá)特征及超微結(jié)構(gòu),最后探討CB1R是否參與活化狀態(tài)星形膠質(zhì)細(xì)胞的促興奮機(jī)制。
　　方法：
　　首先收集15例顳葉癲癇患者及5例急性腦外傷患者手術(shù)切除的海馬組織分別作為癲

4、癇組和對照組,應(yīng)用免疫熒光雙標(biāo)和激光共聚焦顯微鏡技術(shù),觀察硬化海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞上CB1R的表達(dá)特征;依據(jù)TLE硬化海馬組織中星形膠質(zhì)細(xì)胞的CB1R表達(dá)高低將患者分為陽性表達(dá)組和陰性表達(dá)組,對兩組患者的年齡、發(fā)病年齡、病程、平均發(fā)作持續(xù)時間、平均發(fā)作頻率等臨床指標(biāo)進(jìn)行比較,將具有顯著性差異的指標(biāo)和星形膠質(zhì)細(xì)胞CB1R的表達(dá)進(jìn)行相關(guān)性分析;然后制作鋰-匹羅卡品大鼠癲癇模型,模擬TLE發(fā)生過程和海馬硬化,分別在癲癇持續(xù)狀態(tài)(status ep

5、ilepticus,SE)后3天和4周應(yīng)用免疫熒光雙標(biāo)和激光共聚焦顯微鏡檢測海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞上CB1R表達(dá);在SE后4周通過免疫電鏡對硬化海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞上的CB1R進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)觀察;最后體外進(jìn)行星形膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng),用促炎物質(zhì)脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)對其進(jìn)行干預(yù),模擬TLE海馬硬化時星形膠質(zhì)細(xì)胞的變化;使用TUNNEL法檢測細(xì)胞凋亡,MTT法檢測細(xì)胞存活率;利用免疫細(xì)胞化學(xué)和激光共聚焦技術(shù)檢測LPS干預(yù)后

6、星形膠質(zhì)細(xì)胞的CB1R分布變化,并利用Western Blot檢測LPS干預(yù)后星形膠質(zhì)細(xì)胞上CB1R的表達(dá)改變;對LPS處理后的星形膠質(zhì)細(xì)胞和未處理的星形膠質(zhì)細(xì)胞同時給與CB1R激動劑WIN55212-2干預(yù),應(yīng)用高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用法(HPLC-MS/MS)檢測兩組細(xì)胞外液中的谷氨酸濃度,同時使用激光共聚焦顯微鏡-鈣成像技術(shù)檢測星形膠質(zhì)細(xì)胞胞內(nèi)鈣離子濃度的變化。
　　結(jié)果：
　　(1)在對臨床標(biāo)本的研究中,對照組所

7、有患者海馬組織星形膠質(zhì)細(xì)胞上沒有檢測到CB1R表達(dá),而在TLE患者硬化海馬組織的星形膠質(zhì)細(xì)胞上有9例檢測到CB1R表達(dá),6例沒有檢測到CB1R表達(dá);
　　(2)星形膠質(zhì)細(xì)胞上CB1R表達(dá)陽性和陰性的兩組TLE患者的平均每月發(fā)作次數(shù)存在顯著性差異,且相關(guān)性分析顯示硬化海馬表達(dá)CB1R的星形膠質(zhì)細(xì)胞的陽性率和癲癇發(fā)作頻率存在正相關(guān);
　　(3)在動物在體實驗中,生理鹽水對照組大鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞上沒有檢測到CB1R表達(dá),而癲癇組

8、大鼠在SE后3天CB1R就已經(jīng)開始表達(dá)于部分海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞,SE后4周時大鼠海馬表現(xiàn)出神經(jīng)元丟失和星形膠質(zhì)細(xì)胞增生,且?guī)缀跛行切文z質(zhì)細(xì)胞呈CB1R陽性表達(dá);
　　(4)SE后4周的超微結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn),生理鹽水對照組星形膠質(zhì)細(xì)胞極少出現(xiàn)CB1R表達(dá),但是在硬化海馬增生肥大的星形膠質(zhì)細(xì)胞上CB1R表達(dá)明顯,并且部分CB1R表達(dá)于增生肥大星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞膜上;
　　(5)在離體細(xì)胞實驗中,LPS干預(yù)導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞激活,同時其

9、CB1R表達(dá)增多,并且分布從細(xì)胞核周圍向遠(yuǎn)離細(xì)胞核方向移動;
　　(6)CB1R激動劑WIN55212-2引起LPS干預(yù)星形膠質(zhì)細(xì)胞的胞內(nèi)Ca2+熒光值增加幅度明顯高于正常對照增加的幅度,同時,WIN55212-2引起LPS干預(yù)細(xì)胞外液中谷氨酸濃度明顯增加,且明顯高于正常對照增加的幅度。
　　結(jié)論：
　　部分TLE患者硬化海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞存在CB1R表達(dá),且CB1R陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞的百分率與發(fā)作頻率存在直接聯(lián)系,提示星