壁虎醇提物有效成份分離及抗消化道腫瘤作用研究.pdf

1、目的：從壁虎醇提物（Gecko alcohol extract，GAE）分離出壁虎粗多肽
　?。℅ecko Crude Peptides，GCPs），研究其抗消化道腫瘤作用并初步探討其抗腫瘤機(jī)制。
　　方法：
　?。?）分離及鑒定使用飽和度為25％ pH為7.0的硫酸銨溶液溶解多肽，再使用飽和度為50% pH為4.6的硫酸銨溶液析出多肽，析出的多肽使用截留分子量為3500Da的透析袋除鹽，得到GCPs；高效液相色譜法（

2、HPLC）和聚丙烯酰胺凝膠電泳法（Trincine-SDS-PAGE）初步確定GCPs的極性及分子量。
　?。?）體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)體外培養(yǎng)食管癌細(xì)胞EC109、肝癌細(xì)胞HepG2和胃癌細(xì)胞MGC803，使用倒置顯微鏡觀察不同濃度的GCPs分別作用3種細(xì)胞24h、48h、72h各個(gè)時(shí)間段細(xì)胞形態(tài)的改變；MTT法檢測(cè)3 mg/mL、1.5 mg/mL、1 mg/mL、0.75 mg/mL、0.375 mg/mL的GCPs在24h、48h、

3、72h對(duì)3種細(xì)胞增殖的抑制作用，western-blot檢測(cè)肝癌細(xì)胞HepG2中增殖蛋白PCNA的表達(dá)，并采用Hoechst33258熒光染色觀察肝癌細(xì)胞HepG2凋亡的形態(tài)學(xué)改變,TUNEL法檢測(cè)凋亡率；western-blot檢測(cè)凋亡蛋白bcl-2和bax的表達(dá),觀察GCPs對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響。
　?。?）體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)50只H22移植瘤雄性小鼠，腹腔注射給藥，以阿霉素為陽(yáng)性對(duì)照，觀察高、中、低濃度GCPs對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑

4、制作用，小鼠血清中白細(xì)胞數(shù)的變化及對(duì)小鼠胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)的影響；western-blot檢測(cè)腫瘤組織中VEGF蛋白的表達(dá)；ELISA法測(cè)定小鼠血清中TNF-α和IL-6的含量。
　　結(jié)果：（1）對(duì)GAE分離得到的GCPs進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其為多種極性不同、分子量約在3.5～40KDa范圍內(nèi)的小分子多肽的混合物。（2）體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示GCPs（3 mg/mL、1.5 mg/mL、1 mg/mL、0.75 mg/mL、0.375 mg/

5、mL）作用于食管癌細(xì)胞EC109、肝癌細(xì)胞HepG2和胃癌細(xì)胞MGC803，24h、48h和72h后細(xì)胞出現(xiàn)形態(tài)改變，除了0.375 mg/mL的GCPs在24h時(shí)作用不明顯之外，其他濃度均可顯著抑制3種消化道腫瘤細(xì)胞的增殖，對(duì)EC109、HepG2和
　　MGC803細(xì)胞作用48h后的IC50分別為1.1 mg/mL、1.2 mg/mL、1.6 mg/mL。（3）使用Hoechst33258熒光染色顯示用GCPs（1.6 mg/

6、mL和0.8 mg/mL）處理HepG2細(xì)胞48h后出現(xiàn)染色質(zhì)濃縮、邊緣化等典型細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變；TUNEL法檢測(cè)顯示GCPs（1.6 mg/mL和0.8 mg/mL）組細(xì)胞凋亡率（30.16±2.73%和25.84±3.22%）明顯高于對(duì)照組（4.86±0.67%）；GCPs（1.6 mg/mL和0.8 mg/mL）作用HepG2細(xì)胞48h后檢測(cè)蛋白bcl-2和bax的表達(dá)，與對(duì)照組比較,GCPs（1.6 mg/mL和0.8 mg

7、/mL）組HepG2細(xì)胞bcl-2蛋白表達(dá)降低，bax蛋白表達(dá)升高，從而，bcl-2/bax比值降低。（4）體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示腹腔注射GCPs高劑量組、中劑量組和低劑量組（80 mg/kg、40 mg/kg和20 mg/kg）對(duì)小鼠H22移植腫瘤具有顯著的抑制作用，與模型組比較，平均瘤重均明顯降低（P＜0.05），抑瘤率分別為65.9%、57.7%和44.5%，呈現(xiàn)劑量依賴性。（5）GCPs高劑量可不同程度地升高H22小鼠的白細(xì)胞數(shù)和胸腺