牙齦間充質(zhì)干細胞與牙周膜、真皮干細胞的比較及成牙能力的研究.pdf

1、牙齒的發(fā)生和發(fā)育是由釉質(zhì)形成所需的牙源性上皮細胞和形成牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體的牙源性間充質(zhì)細胞共同來完成。因此牙齒的再生必須要有兩種細胞：上皮和間充質(zhì)細胞。組織工程化牙齒研究的關(guān)鍵在于：獲取來源豐富且具有成牙潛能的種子細胞，使其在適宜的成牙微環(huán)境下發(fā)育、分化。由于牙源性種子細胞的難以獲得，所以尋找合適的的成體干細胞作為種子細胞是再生研究的重要目標(biāo)。人牙齦成纖維細胞是口腔粘膜牙齦組織的主要細胞，在牙齦、牙周組織的生理和病理中起重要作用。這種細胞

2、來源豐富，有很強的生長和自我繁殖能力。依據(jù)真皮組織干細胞的研究進展情況來看，由于口腔粘膜與皮膚類似所以提示研究者在口腔粘膜中也應(yīng)該含有類似的成體干細胞存在。因成體干細胞具有可塑性,如能從牙齦固有層中分離出間充質(zhì)干細胞,將非牙源性成體干細胞誘導(dǎo)分化為牙源性細胞,將為組織工程牙齒的構(gòu)建提供新的種子細胞來源。本研究采用組織塊和胰酶消化法原代培養(yǎng)人牙齦間充質(zhì)干細胞、牙周膜干細胞和真皮干細胞，并對牙齦間充質(zhì)干細胞生物學(xué)特性進行鑒定。在此基礎(chǔ)上利用

3、SD大鼠發(fā)育早期的牙胚條件培養(yǎng)液來誘導(dǎo)牙齦間充質(zhì)干細胞向特定方向分化的可能性，探討牙齦間充質(zhì)干細胞向牙源性間充質(zhì)細胞分化的能力。為篩選和誘導(dǎo)組織工程牙齒種子細胞提供研究參考。取得的主要研究結(jié)果如下：
　　1.牙齦間充質(zhì)干細胞的分離、培養(yǎng)、鑒定及生物學(xué)特性的研究
　　經(jīng)患者/監(jiān)護人同意后取臨床上導(dǎo)萌術(shù)或者智齒拔出時切下的牙齦采用組織塊和胰酶消化法進行牙齦間充質(zhì)干細胞原代培養(yǎng)。利用磁珠分選法和有限稀釋法對原代培養(yǎng)的牙齦間充質(zhì)細胞

4、進行篩選純化，將克隆形成的細胞在倒置顯微鏡下觀察其形態(tài)及生長狀況。對篩選細胞的增殖能力、細胞表型以及細胞周期的特性進行分析。結(jié)果顯示所培養(yǎng)的牙齦間充質(zhì)干細胞的形態(tài)多為長梭形，為典型的成纖維細胞形態(tài)。使用流式細胞儀檢測牙齦間充質(zhì)干細胞表型，結(jié)果顯示對于間充質(zhì)干細胞的標(biāo)志物CD29、CD90分別有99.8％和99.4％的表達陽性。說明了我們獲取的細胞具有間充質(zhì)干細胞生物學(xué)特性。與此同時對于CD34和CD45的低表達也表明我們培養(yǎng)的牙齦纖維來

5、源的間充質(zhì)干細胞為非造血系來源細胞。牙齦間充質(zhì)干細胞具有克隆形成能力，生長狀態(tài)穩(wěn)定，經(jīng)誘導(dǎo)后有成骨和成脂肪能力。流式細胞周期分析顯示所培養(yǎng)的細胞多數(shù)處于G0/G1期。免疫化學(xué)檢測間充質(zhì)干細胞標(biāo)志物CD105、CD146、STOR-1細胞均呈陽性表達；增殖細胞核抗原Ki67，多數(shù)細胞呈陽性且增殖旺盛。由此看來確定所分離細胞為間充質(zhì)干細胞。
　　2.牙齦固有層間充質(zhì)干細胞與牙周膜、真皮干細胞的生物學(xué)特性比較.
　　為進一步探討牙

6、齦固有層間充質(zhì)干細胞的生物學(xué)特性，我們對人牙齦間充質(zhì)干細胞、牙周膜干細胞和真皮干細胞采用組織塊法進行原代培養(yǎng)。繪制生長曲線，測定三者堿性磷酸酶活性；使用流式細胞術(shù)檢測三種細胞的表面分子表達、細胞增殖檢測（MTT、細胞周期分析）、多向分化（成脂、成骨）能力檢測、RT-PCR檢測。觀察對比三種細胞其形態(tài)、生長方式、增殖能力等生物學(xué)特性的異同。結(jié)果顯示，光鏡下觀察三種細胞在形態(tài)和結(jié)構(gòu)上相似。牙齦間充質(zhì)干細胞原代培養(yǎng)成功率及細胞增殖能力明顯高于

7、牙周膜干細胞但低于真皮干細胞。流式細胞術(shù)在檢測三種干細胞的表面分子CD90、CD105表達中，牙齦間充質(zhì)干細胞表達最高。在PCR檢測中牙周膜干細胞、牙齦間充質(zhì)干細胞的I型膠原表達強于真皮干細胞，Ⅲ型膠原表達牙周膜干細胞最強，真皮干細胞其次，牙齦間充質(zhì)干細胞表達最弱。牙齦間充質(zhì)細胞的ALP水平明顯高于真皮干細胞，但低于牙周膜干細胞。成脂、成骨多向分化能力檢測中牙周膜干細胞＞牙齦間充質(zhì)干細胞＞真皮干細胞。結(jié)論：牙周膜干細胞具有較強的成骨能力

8、，是理想的牙齒組織工程的種子細胞。牙齦間充質(zhì)干細胞成脂成骨能力優(yōu)于真皮干細胞易于培養(yǎng)成活，增殖力強，具有牙周膜干細胞的一些特點，也可考慮作為牙齒組織工程的種子細胞。
　　3.牙胚條件培養(yǎng)基對牙齦間充質(zhì)干細胞牙向分化的體外誘導(dǎo)研究
　　以牙胚細胞條件培養(yǎng)液為輔助誘導(dǎo)液對牙齦間充質(zhì)干細胞提供成牙微環(huán)境，誘導(dǎo)牙齦間充質(zhì)干細胞進行牙向分化誘導(dǎo)。結(jié)果表明,牙齦間充質(zhì)干細胞經(jīng)過體外一段時間的牙胚條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)后，細胞增殖能力變強；牙齦間