牙齦間充質干細胞與牙周膜干細胞膜片牙周再生能力的實驗研究.pdf

1、背景和目的：
　　牙周病治療的最終目標是能夠消除牙周組織局部的炎癥，再生和重建因炎癥破壞的牙周組織，即再生和重建具有功能學意義的牙周膜、牙骨質和骨組織。但是由于牙周疾病病因學和口腔微環(huán)境的復雜性和特殊性，目前尚無療效滿意的治療方法。近年來，基于干細胞技術的組織工程學治療方法為牙周組織再生研究提供了新的思路與方法。種子細胞、支架材料、生長因子是傳統(tǒng)組織工程學研究領域主要的研究內容，其中，尋找來源豐富、取材方便、具有增殖分化潛能的種子

2、細胞以及合適的細胞移植載體是目前組織再生醫(yī)學研究中的熱點領域。
　　目前，多種成體干細胞已被應用于牙周再生醫(yī)學，其中，骨髓基質干細胞(Bone marrow stem cells，BMSCs)和牙周膜干細胞(periodontal ligament stem cells，PDLSCs)被認為是較理想的種子細胞。但BMSCs從骨髓中獲得，取材困難，取材過程痛苦，細胞的特性與供者的年齡密切相關，且它的自我更新和分化潛能有限，這些缺點限

3、制了BMSCs的臨床應用。PDLSCs是近些年從牙周膜中分離出來的成體干細胞，可以分化為成牙骨質細胞、成骨細胞和牙周韌帶細胞，具有很強的分化增殖能力，目前被認為是牙周再生治療中較理想的種子細胞。但是PDLSCs需要拔除牙齒才能獲得，細胞來源少，分離純化困難。以上這些特點限制了這兩種細胞在未來的牙周再生治療中的廣泛應用。
　　牙齦干細胞(GMSCs)是近幾年國外學者從牙齦中分離出來的前體細胞，具有間充質干細胞的特性，具有集落生成能力

4、、自我更新能力、多向分化潛能和體內成骨能力，成為干細胞治療的又一備選細胞。GMSCs還具有取材容易，來源豐富，抗炎和免疫調節(jié)等優(yōu)點?；谝陨咸攸c，將GMSCs應用于牙周組織再生，具有可行性和良好的臨床推廣應用價值。但目前對于GMSCs促進牙周再生的確切作用及其可能存在的機制尚需要大量深入的研究。
　　在組織工程研究中，種子細胞的植入載體和移植途徑對于組織再生具有至關重要的作用。細胞膜片技術(Cell sheet，CS)是在組織再生

5、領域中具有廣闊應用前景的一項移植策略。由于其保存了細胞間自分泌信號分子和細胞外基質，減少了細胞移植后無效移植細胞的數(shù)量，有利于組織的重建或再生，細胞膜片技術在牙周組織工程中的應用也逐漸展開并被證實具有顯著促進牙周組織再生的作用。
　　本研究通過體外制備GMSCs和PDLSCs膜片，利用比格犬Ⅲ度根分叉病變模型，探討并比較GMSCs和PDLSCs修復炎癥破壞的牙周組織缺損的能力，為GMSCs在牙周組織工程中的臨床應用提供證據。

6、>　　方法：
　　1.牙齦間充質干細胞和牙周膜干細胞的分離培養(yǎng)和鑒定
　　1.1、GMSCs的分離培養(yǎng)
　　利用酶消化和組織塊混合培養(yǎng)法從臨床上需行阻生牙拔除、正畸助萌、牙冠延長術的牙周健康患者的牙齦中獲得原代細胞，消化傳代后，取P2-P4的細胞供后續(xù)實驗使用。利用有限稀釋法，挑取單克隆獲得具有干細胞特性的細胞GMSCs進行傳代培養(yǎng)。
　　1.2、PDLSCs的分離培養(yǎng)
　　利用酶消化和組織塊混合培養(yǎng)法從臨

7、床阻生拔除的第三磨牙和因正畸需要拔除的健康前磨牙（牙根已發(fā)育完成）的牙周膜中獲得原代細胞，消化傳代后，取P2-P4的細胞供后續(xù)實驗使用。利用有限稀釋法，挑取單克隆獲得具有干細胞特性的細胞PDLSCs進行傳代培養(yǎng)。
　　1.3、干細胞特性及多向分化能力鑒定
　　分別對分離純化的GMSCs和PDLSCs進行克隆形成率(CFU-F)分析，流式細胞術檢測細胞表面分子表達。在體外以0.1μM地塞米松，10mMβ-甘油磷酸鈉，50mg/

8、ml維生素C-二磷酸鹽分別誘導GMSCs和PDLSCs向成骨細胞分化，茜素紅染色法檢測鈣化結節(jié)的形成;以0.1μM地塞米松，60μM吲哚美辛，50mg/ml維生素C二磷酸鹽分別誘導以上兩種細胞向脂肪細胞分化并用油紅O(Oil Red(O))染色檢測脂肪滴的形成。
　　2.GMSCs和PDLSCs細胞膜片的制備及生物學活性檢測
　　將生長增殖狀態(tài)良好的P4代GMSCs與PDLSCs以1×104細胞/cm2的密度將細胞分別均勻接

9、種培養(yǎng)皿和6孔板中，分為三組誘導培養(yǎng)。
　　1）膜片誘導培養(yǎng)液組:α-MEM+15％FBS，0.1μM地塞米松，10mMβ-甘油磷酸鈉，100mg/ml維生素C;
　　2）礦化誘導培養(yǎng)液組:α-MEM+15％FBS，0.1μM地塞米松，10mMβ-甘油磷酸鈉，50mg/ml維生素C;
　　3）普通培養(yǎng)液組:α-MEM+15％FBS;孵育10-12天后觀察三組培養(yǎng)條件下細胞成膜能力。獲得的GMSCs和PDLSCs細胞膜片

10、行H&E染色進行組織學觀察和ALP活性測定。
　　3.牙齦間充質干細胞和牙周膜干細胞膜片對牙周再生作用的體內研究
　　本實驗利用包被有eGFP的慢病毒分別轉染GMSCs和PDLSCs，經藥物篩選后獲得穩(wěn)定表達eGFP的GMSCs和PDLSCs。將這些細胞制備成細胞膜片移植入比格犬牙周炎Ⅲ度根分叉病變模型，8周后處死動物，利用H&E染色、免疫組織化學染色、天狼星紅染色及直接熒光顯微鏡觀察，評價GMSCs和PDLSCs對牙周缺損

11、的修復再生能力。
　　結果：
　　1.牙齦間充質干細胞和牙周膜干細胞的分離培養(yǎng)和鑒定
　　原代培養(yǎng)3天后，倒置顯微鏡觀察即可見分散的細胞貼壁伸展，當細胞密度達到瓶底的70％-80％時，即可進行傳代培養(yǎng)。GMSCs和PDLCs在體外均呈集落樣增殖，所形成的克隆形態(tài)和大小未見明顯差異。克隆形成率分析(CFU-F)結果顯示，GMSCs的克隆形成能力略高于PDLSCs。用有限稀釋法獲得成纖維細胞集落克隆形成單位，將單個克隆擴大

12、培養(yǎng)，獲得具有自我更新能力的人GMSCs和PDLSCs。經流式細胞儀檢測細胞表面標記發(fā)現(xiàn)，該兩種細胞均表達CD29、CD105、CD90、CD73、STRO-1，而不表達CD14、CD45、CD144、CD31以及HLA-DR。GMSCs和PDLSCs經成骨誘導培養(yǎng)基誘導4周后，經茜素紅染色后均能觀察到大小不一的紅染的礦化結節(jié)，GMSCs形成的單個礦化結節(jié)的面積較PDLSCs的小而分散;GMSCs和PDLSCs向脂肪細胞方向誘導2周后，

13、經油紅O染色，可見有紅色脂肪小滴形成，兩種細胞形成脂滴的形態(tài)無明顯差別。
　　2.牙齦間充質干細胞和牙周膜干細胞膜片的制備及生物學活性檢測
　　GMSCs和PDLSCs分別在三種培養(yǎng)液中誘導培養(yǎng)，從誘導第3天開始倒置顯微鏡下即可觀察到大量沉積的細胞外基質，GMSCs的基質分泌量及分布較PDLSCs更為迅速、均勻。誘導培養(yǎng)10-12天后，收集膜片，添加有100mg/ml維生素C的膜片誘導培養(yǎng)液組可形成完整的細胞膜片，能夠完整地

14、自培養(yǎng)皿底剝離，可折疊成需要的形狀。添加有50mg/ml維生素C的礦化誘導培養(yǎng)液組形成的細胞膜片易破碎，不能完整的自培養(yǎng)皿底剝離。未添加維生素C的普通培養(yǎng)液組的細胞無法形成膜片。膜片誘導培養(yǎng)液組的細胞膜片H&E染色顯示膜片由2-3層細胞組成，細胞間富含大量的細胞外基質。ALP活性檢測顯示兩組細胞經誘導培養(yǎng)后均明顯增強，50mg/ml維生素C培養(yǎng)組（即礦化誘導培養(yǎng)液組）略低于100mg/ml維生素C培養(yǎng)組（膜片誘導培養(yǎng)液組），兩種細胞在相

15、同培養(yǎng)條件下PDLSCs的ALP表達水平均略高于GMSCs，在礦化誘導液組差異有統(tǒng)計學意義，但在膜片誘導培養(yǎng)組兩種細胞的ALP活性差異無統(tǒng)計學意義。
　　3.牙齦間充質干細胞和牙周膜干細胞膜片對牙周再生作用的體內研究
　　含有eGFP的慢病毒轉染P3-P4代GMSCs和PDLSCs，轉染后48-72h多數(shù)細胞均可發(fā)出明亮的綠色熒光，感染效率達90％左右。然后對細胞進行藥物篩選純化，獲得穩(wěn)定表達的eGFP的GMSCS和PDLS

16、Cs。擴大培養(yǎng)后，于膜片誘導液中誘導培養(yǎng)10-12天收集細胞膜片，折疊后移植入比格犬Ⅲ度根分叉病變模型。8周后處死動物獲取下頜骨標本，切片進行H&E染色、免疫組織化學染色、天狼星紅染色及直接熒光顯微鏡觀察。組織形態(tài)學計量分析結果顯示:GMSCs和PDLSCs膜片移植組的新生牙骨質百分比(PRC)和新生骨面積百分比(PRB)顯著高于空白對照組，但兩種細胞膜片組間差異無統(tǒng)計學意義;免疫組織化學結果顯示GMSCs和PDLSCs移植組新生骨中G

17、FP的表達均呈強陽性，而對照組中GFP染色則為陰性。熒光顯微鏡下觀察，大部分新生骨在顯微鏡下呈明亮的綠色，在新生牙骨質、牙槽骨中的成牙骨質細胞和成骨細胞中均有綠色熒光的表達。偏振光顯微鏡觀察天狼星紅染色標本，在GMSCs和PDLSCs膜片植入組再生的膠原纖維多數(shù)呈垂直或斜行插入新生牙骨質，為功能性牙周膜，而空白對照組牙周膜纖維束多平行于牙根面，提示該纖維無正常功能。
　　結論：
　　1.GMSCs同PDLSCs一樣具有自我更

18、新的能力，能夠表達干細胞特異性的表面標記，并且具有多向分化的能力。
　　2.添加100mg/ml維生素C的成骨誘導液既能誘導細胞向成骨細胞方向分化，而且能夠誘導細胞大量分泌細胞外基質形成細胞膜片，是一種較簡單、有效的膜片制備手段。
　　3.GMSCs和PDLSCs膜片表達類似的ALP活性，用于犬Ⅲ度根分叉病變模型有類似的促牙周組織再生效果。
　　4.移植的GMSCs和PDLSCs促進牙周再生的機制包括移植細胞直接分化為