牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞與牙周膜干細(xì)胞膜片牙周再生能力的實驗研究.pdf

1、背景和目的：
　　牙周病治療的最終目標(biāo)是能夠消除牙周組織局部的炎癥，再生和重建因炎癥破壞的牙周組織，即再生和重建具有功能學(xué)意義的牙周膜、牙骨質(zhì)和骨組織。但是由于牙周疾病病因?qū)W和口腔微環(huán)境的復(fù)雜性和特殊性，目前尚無療效滿意的治療方法。近年來，基于干細(xì)胞技術(shù)的組織工程學(xué)治療方法為牙周組織再生研究提供了新的思路與方法。種子細(xì)胞、支架材料、生長因子是傳統(tǒng)組織工程學(xué)研究領(lǐng)域主要的研究內(nèi)容，其中，尋找來源豐富、取材方便、具有增殖分化潛能的種子

2、細(xì)胞以及合適的細(xì)胞移植載體是目前組織再生醫(yī)學(xué)研究中的熱點領(lǐng)域。
　　目前，多種成體干細(xì)胞已被應(yīng)用于牙周再生醫(yī)學(xué)，其中，骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow stem cells，BMSCs)和牙周膜干細(xì)胞(periodontal ligament stem cells，PDLSCs)被認(rèn)為是較理想的種子細(xì)胞。但BMSCs從骨髓中獲得，取材困難，取材過程痛苦，細(xì)胞的特性與供者的年齡密切相關(guān)，且它的自我更新和分化潛能有限，這些缺點限

3、制了BMSCs的臨床應(yīng)用。PDLSCs是近些年從牙周膜中分離出來的成體干細(xì)胞，可以分化為成牙骨質(zhì)細(xì)胞、成骨細(xì)胞和牙周韌帶細(xì)胞，具有很強(qiáng)的分化增殖能力，目前被認(rèn)為是牙周再生治療中較理想的種子細(xì)胞。但是PDLSCs需要拔除牙齒才能獲得，細(xì)胞來源少，分離純化困難。以上這些特點限制了這兩種細(xì)胞在未來的牙周再生治療中的廣泛應(yīng)用。
　　牙齦干細(xì)胞(GMSCs)是近幾年國外學(xué)者從牙齦中分離出來的前體細(xì)胞，具有間充質(zhì)干細(xì)胞的特性，具有集落生成能力

4、、自我更新能力、多向分化潛能和體內(nèi)成骨能力，成為干細(xì)胞治療的又一備選細(xì)胞。GMSCs還具有取材容易，來源豐富，抗炎和免疫調(diào)節(jié)等優(yōu)點。基于以上特點，將GMSCs應(yīng)用于牙周組織再生，具有可行性和良好的臨床推廣應(yīng)用價值。但目前對于GMSCs促進(jìn)牙周再生的確切作用及其可能存在的機(jī)制尚需要大量深入的研究。
　　在組織工程研究中，種子細(xì)胞的植入載體和移植途徑對于組織再生具有至關(guān)重要的作用。細(xì)胞膜片技術(shù)(Cell sheet，CS)是在組織再生

5、領(lǐng)域中具有廣闊應(yīng)用前景的一項移植策略。由于其保存了細(xì)胞間自分泌信號分子和細(xì)胞外基質(zhì)，減少了細(xì)胞移植后無效移植細(xì)胞的數(shù)量，有利于組織的重建或再生，細(xì)胞膜片技術(shù)在牙周組織工程中的應(yīng)用也逐漸展開并被證實具有顯著促進(jìn)牙周組織再生的作用。
　　本研究通過體外制備GMSCs和PDLSCs膜片，利用比格犬Ⅲ度根分叉病變模型，探討并比較GMSCs和PDLSCs修復(fù)炎癥破壞的牙周組織缺損的能力，為GMSCs在牙周組織工程中的臨床應(yīng)用提供證據(jù)。

6、>　　方法：
　　1.牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞和牙周膜干細(xì)胞的分離培養(yǎng)和鑒定
　　1.1、GMSCs的分離培養(yǎng)
　　利用酶消化和組織塊混合培養(yǎng)法從臨床上需行阻生牙拔除、正畸助萌、牙冠延長術(shù)的牙周健康患者的牙齦中獲得原代細(xì)胞，消化傳代后，取P2-P4的細(xì)胞供后續(xù)實驗使用。利用有限稀釋法，挑取單克隆獲得具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞GMSCs進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
　　1.2、PDLSCs的分離培養(yǎng)
　　利用酶消化和組織塊混合培養(yǎng)法從臨

7、床阻生拔除的第三磨牙和因正畸需要拔除的健康前磨牙（牙根已發(fā)育完成）的牙周膜中獲得原代細(xì)胞，消化傳代后，取P2-P4的細(xì)胞供后續(xù)實驗使用。利用有限稀釋法，挑取單克隆獲得具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞PDLSCs進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
　　1.3、干細(xì)胞特性及多向分化能力鑒定
　　分別對分離純化的GMSCs和PDLSCs進(jìn)行克隆形成率(CFU-F)分析，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面分子表達(dá)。在體外以0.1μM地塞米松，10mMβ-甘油磷酸鈉，50mg/

8、ml維生素C-二磷酸鹽分別誘導(dǎo)GMSCs和PDLSCs向成骨細(xì)胞分化，茜素紅染色法檢測鈣化結(jié)節(jié)的形成;以0.1μM地塞米松，60μM吲哚美辛，50mg/ml維生素C二磷酸鹽分別誘導(dǎo)以上兩種細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化并用油紅O(Oil Red(O))染色檢測脂肪滴的形成。
　　2.GMSCs和PDLSCs細(xì)胞膜片的制備及生物學(xué)活性檢測
　　將生長增殖狀態(tài)良好的P4代GMSCs與PDLSCs以1×104細(xì)胞/cm2的密度將細(xì)胞分別均勻接

9、種培養(yǎng)皿和6孔板中，分為三組誘導(dǎo)培養(yǎng)。
　　1）膜片誘導(dǎo)培養(yǎng)液組:α-MEM+15％FBS，0.1μM地塞米松，10mMβ-甘油磷酸鈉，100mg/ml維生素C;
　　2）礦化誘導(dǎo)培養(yǎng)液組:α-MEM+15％FBS，0.1μM地塞米松，10mMβ-甘油磷酸鈉，50mg/ml維生素C;
　　3）普通培養(yǎng)液組:α-MEM+15％FBS;孵育10-12天后觀察三組培養(yǎng)條件下細(xì)胞成膜能力。獲得的GMSCs和PDLSCs細(xì)胞膜片

10、行H&E染色進(jìn)行組織學(xué)觀察和ALP活性測定。
　　3.牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞和牙周膜干細(xì)胞膜片對牙周再生作用的體內(nèi)研究
　　本實驗利用包被有eGFP的慢病毒分別轉(zhuǎn)染GMSCs和PDLSCs，經(jīng)藥物篩選后獲得穩(wěn)定表達(dá)eGFP的GMSCs和PDLSCs。將這些細(xì)胞制備成細(xì)胞膜片移植入比格犬牙周炎Ⅲ度根分叉病變模型，8周后處死動物，利用H&E染色、免疫組織化學(xué)染色、天狼星紅染色及直接熒光顯微鏡觀察，評價GMSCs和PDLSCs對牙周缺損

11、的修復(fù)再生能力。
　　結(jié)果：
　　1.牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞和牙周膜干細(xì)胞的分離培養(yǎng)和鑒定
　　原代培養(yǎng)3天后，倒置顯微鏡觀察即可見分散的細(xì)胞貼壁伸展，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到瓶底的70％-80％時，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。GMSCs和PDLCs在體外均呈集落樣增殖，所形成的克隆形態(tài)和大小未見明顯差異?？寺⌒纬陕史治?CFU-F)結(jié)果顯示，GMSCs的克隆形成能力略高于PDLSCs。用有限稀釋法獲得成纖維細(xì)胞集落克隆形成單位，將單個克隆擴(kuò)大

12、培養(yǎng)，獲得具有自我更新能力的人GMSCs和PDLSCs。經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面標(biāo)記發(fā)現(xiàn)，該兩種細(xì)胞均表達(dá)CD29、CD105、CD90、CD73、STRO-1，而不表達(dá)CD14、CD45、CD144、CD31以及HLA-DR。GMSCs和PDLSCs經(jīng)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)4周后，經(jīng)茜素紅染色后均能觀察到大小不一的紅染的礦化結(jié)節(jié)，GMSCs形成的單個礦化結(jié)節(jié)的面積較PDLSCs的小而分散;GMSCs和PDLSCs向脂肪細(xì)胞方向誘導(dǎo)2周后，

13、經(jīng)油紅O染色，可見有紅色脂肪小滴形成，兩種細(xì)胞形成脂滴的形態(tài)無明顯差別。
　　2.牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞和牙周膜干細(xì)胞膜片的制備及生物學(xué)活性檢測
　　GMSCs和PDLSCs分別在三種培養(yǎng)液中誘導(dǎo)培養(yǎng)，從誘導(dǎo)第3天開始倒置顯微鏡下即可觀察到大量沉積的細(xì)胞外基質(zhì)，GMSCs的基質(zhì)分泌量及分布較PDLSCs更為迅速、均勻。誘導(dǎo)培養(yǎng)10-12天后，收集膜片，添加有100mg/ml維生素C的膜片誘導(dǎo)培養(yǎng)液組可形成完整的細(xì)胞膜片，能夠完整地

14、自培養(yǎng)皿底剝離，可折疊成需要的形狀。添加有50mg/ml維生素C的礦化誘導(dǎo)培養(yǎng)液組形成的細(xì)胞膜片易破碎，不能完整的自培養(yǎng)皿底剝離。未添加維生素C的普通培養(yǎng)液組的細(xì)胞無法形成膜片。膜片誘導(dǎo)培養(yǎng)液組的細(xì)胞膜片H&E染色顯示膜片由2-3層細(xì)胞組成，細(xì)胞間富含大量的細(xì)胞外基質(zhì)。ALP活性檢測顯示兩組細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)后均明顯增強(qiáng)，50mg/ml維生素C培養(yǎng)組（即礦化誘導(dǎo)培養(yǎng)液組）略低于100mg/ml維生素C培養(yǎng)組（膜片誘導(dǎo)培養(yǎng)液組），兩種細(xì)胞在相

15、同培養(yǎng)條件下PDLSCs的ALP表達(dá)水平均略高于GMSCs，在礦化誘導(dǎo)液組差異有統(tǒng)計學(xué)意義，但在膜片誘導(dǎo)培養(yǎng)組兩種細(xì)胞的ALP活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　3.牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞和牙周膜干細(xì)胞膜片對牙周再生作用的體內(nèi)研究
　　含有eGFP的慢病毒轉(zhuǎn)染P3-P4代GMSCs和PDLSCs，轉(zhuǎn)染后48-72h多數(shù)細(xì)胞均可發(fā)出明亮的綠色熒光，感染效率達(dá)90％左右。然后對細(xì)胞進(jìn)行藥物篩選純化，獲得穩(wěn)定表達(dá)的eGFP的GMSCS和PDLS

16、Cs。擴(kuò)大培養(yǎng)后，于膜片誘導(dǎo)液中誘導(dǎo)培養(yǎng)10-12天收集細(xì)胞膜片，折疊后移植入比格犬Ⅲ度根分叉病變模型。8周后處死動物獲取下頜骨標(biāo)本，切片進(jìn)行H&E染色、免疫組織化學(xué)染色、天狼星紅染色及直接熒光顯微鏡觀察。組織形態(tài)學(xué)計量分析結(jié)果顯示:GMSCs和PDLSCs膜片移植組的新生牙骨質(zhì)百分比(PRC)和新生骨面積百分比(PRB)顯著高于空白對照組，但兩種細(xì)胞膜片組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義;免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示GMSCs和PDLSCs移植組新生骨中G

17、FP的表達(dá)均呈強(qiáng)陽性，而對照組中GFP染色則為陰性。熒光顯微鏡下觀察，大部分新生骨在顯微鏡下呈明亮的綠色，在新生牙骨質(zhì)、牙槽骨中的成牙骨質(zhì)細(xì)胞和成骨細(xì)胞中均有綠色熒光的表達(dá)。偏振光顯微鏡觀察天狼星紅染色標(biāo)本，在GMSCs和PDLSCs膜片植入組再生的膠原纖維多數(shù)呈垂直或斜行插入新生牙骨質(zhì)，為功能性牙周膜，而空白對照組牙周膜纖維束多平行于牙根面，提示該纖維無正常功能。
　　結(jié)論：
　　1.GMSCs同PDLSCs一樣具有自我更

18、新的能力，能夠表達(dá)干細(xì)胞特異性的表面標(biāo)記，并且具有多向分化的能力。
　　2.添加100mg/ml維生素C的成骨誘導(dǎo)液既能誘導(dǎo)細(xì)胞向成骨細(xì)胞方向分化，而且能夠誘導(dǎo)細(xì)胞大量分泌細(xì)胞外基質(zhì)形成細(xì)胞膜片，是一種較簡單、有效的膜片制備手段。
　　3.GMSCs和PDLSCs膜片表達(dá)類似的ALP活性，用于犬Ⅲ度根分叉病變模型有類似的促牙周組織再生效果。
　　4.移植的GMSCs和PDLSCs促進(jìn)牙周再生的機(jī)制包括移植細(xì)胞直接分化為