產(chǎn)KPC酶肺炎克雷伯菌分子流行和質(zhì)粒介導(dǎo)的KPC酶?jìng)鞑C(jī)制研究.pdf

1、最近十年，產(chǎn)碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌成為”超級(jí)耐藥”細(xì)菌并迅速傳遍全球，史無(wú)前例.2009年報(bào)道的來(lái)自印度NDA-1金屬酶、2004報(bào)道的土耳其OXA-48 D類酶以及2001年報(bào)道美國(guó)產(chǎn)生的A類KPC酶均分離自肺炎克雷伯菌，在短期內(nèi)均造成多地區(qū)的廣泛播散。同時(shí)，肺炎克雷伯菌是耐藥質(zhì)粒的“收藏家”，不僅增加自身的生存能力，而且還可以將耐藥質(zhì)粒傳播給其他菌種，造成耐藥基因的播散。自2007中國(guó)首次報(bào)道產(chǎn)KPC酶肺炎克雷伯菌后，已在局部地區(qū)造

2、成流行。本論文主要目的是研究產(chǎn)KPC酶肺炎克雷伯菌在中國(guó)的流行狀況及質(zhì)粒介導(dǎo)的KPC酶基因傳播。
　　 本研究于2010年在全國(guó)20個(gè)省市的61家醫(yī)院收集2971株非重復(fù)的肺炎克雷伯菌，并選擇20種常見抗菌藥物開展體外藥物敏感性試驗(yàn)。對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥或中介的肺炎克雷伯菌進(jìn)行KPC型碳青霉烯酶檢測(cè)。改良Hodge確認(rèn)試驗(yàn)和KPC基因特異引物PCR擴(kuò)增及測(cè)序用于細(xì)菌產(chǎn)KPC酶的確定。采用多位點(diǎn)序列分型(multilocus s

3、equence typing，MLST)分型技術(shù)對(duì)產(chǎn)KPC酶肺炎克雷伯菌進(jìn)行同源性分析。
　　 體外藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示，2971株肺炎克雷伯菌對(duì)亞胺培南、美洛培南和厄他培南的耐藥率分別為1.3％、1.9％和2.7％。肺炎克雷伯菌產(chǎn)ESBLs的檢出率為41.9％。75株碳青霉烯類抗生素耐藥或中介的肺炎克雷伯菌中有28株改良 Hodge試驗(yàn)陽(yáng)性，KPC擴(kuò)增和測(cè)序發(fā)現(xiàn)有25株KPC-2基因陽(yáng)性。產(chǎn)KPC-2酶肺炎克雷伯菌主要來(lái)自浙

4、江省（20株），并在北京、遼寧、湖北、上海和江蘇各檢測(cè)到1株。2010年中國(guó)多地區(qū)產(chǎn)KPC-2酶肺炎克雷伯菌的檢出率0.84％。
　　 25株產(chǎn)KPC-2酶肺炎克雷伯菌MLST分型檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，有17株為ST11，占68％;4株為ST494，4株為未知型，屬于新的ST型。北京、遼寧、湖北、上海和江蘇菌株均為ST11。4株肺炎克雷伯菌ST494來(lái)自浙江的同一家醫(yī)院。
　　 本課題同時(shí)對(duì)來(lái)源于湖北一家省級(jí)兒童醫(yī)院分離的4株產(chǎn)碳青

5、霉烯酶肺炎克雷伯菌進(jìn)行研究。采用PCR擴(kuò)增及測(cè)序檢測(cè)β內(nèi)酰胺酶基因、MLST和脈沖場(chǎng)凝脈電泳(PFGE)技術(shù)進(jìn)行細(xì)菌同源性分析，應(yīng)用質(zhì)粒PFGE、接合及轉(zhuǎn)化試驗(yàn)、質(zhì)粒抽提、Southern雜交等技術(shù)進(jìn)行質(zhì)粒分析及β-內(nèi)酰胺酶基因在質(zhì)粒中的定位。
　　 同源性分析顯示4株肺炎克雷伯菌PFGE圖譜條帶及數(shù)量相同，MLST分型均力ST439，提示4株細(xì)菌為同一克隆。質(zhì)粒圖譜結(jié)果表明4株細(xì)菌攜帶的質(zhì)粒大小在30到300kb這間，KPC-

6、2基因位于30kb大小的質(zhì)粒上，IMP-4基因定位于300kb質(zhì)粒，CTX-M-15基因位于80kb大小的質(zhì)粒上，DHA-1基因分別位于80kb和300kb的2個(gè)質(zhì)粒上。本研究證實(shí)在肺炎克雷伯菌中同時(shí)產(chǎn)生A類碳青霉烯酶(KPC-2)、金屬碳青霉烯酶(IMP-4)、超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(CTX-M-15)和質(zhì)粒介導(dǎo)的AmpC酶(DHA-1)。
　　 本課題還對(duì)分離自同一病人的1株嗜水氣單胞菌、2株大腸埃希菌和2株產(chǎn)氣腸桿菌進(jìn)行藥敏試

7、驗(yàn)、質(zhì)粒消除、PCR步移、質(zhì)粒分析等分子生物學(xué)技術(shù)研究，明確編碼KPC基因在不同質(zhì)粒中的定位及攜帶KPC基因的轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu)。
　　 結(jié)果發(fā)現(xiàn)5株臨床分離細(xì)菌均顯示對(duì)亞胺培南、美洛培南和厄他培南高水平耐藥，MIC值均＞32 mg/L。通過(guò)質(zhì)粒消除試驗(yàn)，嗜水氣單胞菌含KPC基因的質(zhì)粒被去除后，細(xì)菌對(duì)亞胺培南、美洛培南和厄他培南MIC值明顯降低。
　　 PCR擴(kuò)增及測(cè)序證實(shí)在2株產(chǎn)氣腸桿菌均含有blaKPC-2，blaTEM-1

8、，blaSHV-12和blaDHA-1，而它們的接合子中只含blaKPC-2和blaTEM-1。2株大腸埃希菌中檢測(cè)到blaKPC-2和blaSHV-12，而它們的轉(zhuǎn)化子或接合子中只檢測(cè)到blaKPC-2。臨床分離的嗜水氣單胞菌和它的接合子只含blaKPC-2，而質(zhì)粒消除的嗜水氣單胞菌blaKPC-2檢測(cè)陰性。
　　 質(zhì)粒電泳圖譜分析發(fā)現(xiàn)所有5株臨床細(xì)菌都含有3-5個(gè)大小不等的質(zhì)粒。分子雜交表明KPC基因位于嗜水氣單胞菌和大腸埃

9、希菌的30kb可接合或轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒上，而2株產(chǎn)氣腸桿菌攜帶KPC基因的質(zhì)粒大小不同，分別為200kb和170kb左右。對(duì)嗜水氣單胞菌轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR步移法及測(cè)序獲得一個(gè)11467bp核苷酸片段，結(jié)構(gòu)依次為Tn3的轉(zhuǎn)座酶和解旋酶、部分缺失的TEM、ISKpn8、KPC-2、ISKpr6-like、 KorC、KlcA和有缺失的起始復(fù)制蛋白基因。該結(jié)構(gòu)同時(shí)還在其他4株細(xì)菌中檢測(cè)到。
　　 本研究首次在氣單胞菌屬細(xì)菌中檢測(cè)到KPC-2型