安徽省部分醫(yī)院產(chǎn)質(zhì)粒介導(dǎo)AmpC酶的肺炎克雷伯菌耐藥性及其基因型分布.pdf

1、目的：了解安徽省2005年臨床分離的247株肺炎克雷伯菌產(chǎn)質(zhì)粒介導(dǎo)AmpCβ-內(nèi)酰胺酶的情況及產(chǎn)酶菌株的耐藥性。研究產(chǎn)質(zhì)粒介導(dǎo)AmpC β-內(nèi)酰胺酶陽(yáng)性菌株的耐藥基因型別的分布。研究AmpC β-內(nèi)酰胺酶陽(yáng)性菌株其他耐藥基因的分布。研究新酶的生化特性：等電點(diǎn)和酶對(duì)抗菌藥物的水解特性。 方法： 收集安徽省細(xì)菌耐藥監(jiān)控網(wǎng)中的25家市級(jí)醫(yī)院2005年9月(9月1日到30日)從臨床標(biāo)本(去除同一病例相同部位重復(fù)分離的菌株)中分離

2、的肺炎克雷伯菌247株，采用全自動(dòng)微生物分析儀對(duì)標(biāo)本進(jìn)行重新鑒定。經(jīng)頭孢西丁紙片法試驗(yàn)篩選出產(chǎn)AmpC酶菌株，對(duì)初篩陽(yáng)性的細(xì)菌，采用三維試驗(yàn)篩選，質(zhì)粒提取和多重聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增攜帶AmpC酶菌株基因，并用瓊脂平板稀釋法測(cè)定其對(duì)12種抗菌藥物的耐藥性。 將多重PCR擴(kuò)增篩選出的AmpC酶陽(yáng)性的菌株行轉(zhuǎn)移接合試驗(yàn)，對(duì)接合子進(jìn)一步行全編碼引物PCR擴(kuò)增，將全編碼區(qū)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物按Sanger雙脫氧末端終止法，用自動(dòng)測(cè)序儀對(duì)其

3、進(jìn)行測(cè)序以鑒定基因型。 以20株AmpC酶陽(yáng)性的菌株總DNA為模板，使用blaCTX-M、blaSHV、blaTEM以及blaOXA組通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增以篩選出ESBLs陽(yáng)性菌株，分析AmpC β-內(nèi)酰胺酶陽(yáng)性菌株其他耐藥基因的分布。 同時(shí)對(duì)有基因突變的菌株進(jìn)行克隆表達(dá)，提酶，進(jìn)行等電點(diǎn)的測(cè)定和酶對(duì)抗菌藥物水解率的研究，并通過(guò)Southern雜交證明其確實(shí)位于質(zhì)粒上。 結(jié)果： 247株肺炎克雷伯桿菌中

4、，采用K-B法初篩出對(duì)頭孢西丁中介或者耐藥的菌株49株，對(duì)49株初篩陽(yáng)性的細(xì)菌采用三維試驗(yàn)，質(zhì)粒提取和多重PCR進(jìn)一步篩選出產(chǎn)Ampc酶陽(yáng)性菌20株，占40.8％(20/49)。據(jù)引物擴(kuò)增片段大小(DHA為405bp，EBC為302bp，CIT為462bp)，判定其中DHA型14株，EBC型4株，CIT型2株。20株AmpC酶陽(yáng)性菌對(duì)頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢西丁的耐藥率均在55％以上，對(duì)哌拉西林/他唑巴坦的耐藥率為48.26％，對(duì)頭孢吡

5、肟的耐藥率為31.03％。 將多重PCR擴(kuò)增篩選出的AmpC酶陽(yáng)性的菌株行接合試驗(yàn)，全編碼基因引物擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序后發(fā)現(xiàn)有11株攜帶的AmpC酶為DHA-1型，2株CIT型產(chǎn)物為CMY-2型，EBC型的產(chǎn)物中有3株為ACT-1型，另外1株有突變。突變株中K.preu462與AM076977.1(ACT-2型AmpC酶)比較存在6個(gè)核苷酸突變位點(diǎn)分別是102A→G，303C→G，688G→A，975G→A，990C→T，其中68

6、8位的突變引起氨基酸的改變，由纈氨酸→異亮氨酸，GenBank登錄號(hào)是EFl25013。 使用ESBLs通用引物擴(kuò)增出CTX-M-1陽(yáng)性菌株為1株，CTX-M-9陽(yáng)性菌株為8株，SHV型2株，TEM型9株，OXA-1型1株。發(fā)現(xiàn)有1株攜帶3種以上耐藥基因。 對(duì)K.preu 462菌株克隆表達(dá)，提酶后，等電點(diǎn)測(cè)定為8.6，且酶對(duì)頭孢西丁有高水解率。對(duì)突變株行Southern雜交，證實(shí)其為質(zhì)粒介導(dǎo)。 結(jié)論：

7、安徽省部分醫(yī)院的產(chǎn)質(zhì)粒介導(dǎo)AmpC酶的菌株表現(xiàn)為多重耐藥，除亞胺培南、美羅培南、頭孢吡肟、阿米卡星、哌拉西林/他唑巴坦外，對(duì)其余7種藥物的耐藥率>55％。產(chǎn)酶株較非產(chǎn)酶株對(duì)喹諾同類(lèi)，頭孢吡肟以及含β-內(nèi)酰胺酶抑制劑復(fù)合制劑耐藥率為高，但對(duì)第三代頭孢菌素的耐藥率為低，可能是因?yàn)榉钱a(chǎn)酶菌產(chǎn)ESBLs。目前認(rèn)為可用于治療產(chǎn)AmpC酶細(xì)菌感染的有效抗菌藥物主要是碳青霉烯類(lèi)和第四代頭孢菌素。在我省收集的247株腸桿科細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)17株質(zhì)粒介導(dǎo)的Am