腸桿菌科細(xì)菌KPC碳青霉烯酶的研究.pdf

1、目的：了解上海部分醫(yī)院KPC 酶的發(fā)生及耐藥情況。研究產(chǎn)KPC菌株的碳青霉烯類耐藥機(jī)制、KPC 酶的分子生物學(xué)特性和blaKPC的轉(zhuǎn)移和傳播。運(yùn)用RNAi 技術(shù)探討blaKPC 表達(dá)與碳青霉烯類耐藥的關(guān)系。 方法：1.在上海第六人民醫(yī)院、仁濟(jì)醫(yī)院、瑞金醫(yī)院和華山醫(yī)院收集亞胺培南或美羅培南藥敏結(jié)果（紙片擴(kuò)散法）中介或耐藥的腸桿菌科細(xì)菌，用E-TEST 方法重新測(cè)定細(xì)菌對(duì)各類抗菌藥物的最低抑菌濃度（MIC）。用改良Hodge 試驗(yàn)和

2、硼酸抑制試驗(yàn)進(jìn)行碳青霉烯酶表型的篩選。2.PCR 檢測(cè)blaKPC、測(cè)序，PCR 檢測(cè)膜孔蛋白OmpK35、OmpK36、OmpK37的編碼基因。3.對(duì)產(chǎn)KPC 酶菌株做接合試驗(yàn)、質(zhì)粒電泳、等電聚焦電泳、Southern blot 試驗(yàn)。4.化學(xué)合成SiRNAs，對(duì)blaKPC的表達(dá)進(jìn)行RNA 水平的干擾，檢測(cè)實(shí)驗(yàn)菌株干擾前后亞胺培南和厄他培南的MIC值。 結(jié)果：本研究在上海部分醫(yī)院共收集到7 株對(duì)亞胺培南藥敏結(jié)果（紙片擴(kuò)散法）

3、中介或耐藥的腸桿菌科細(xì)菌。E-TEST 試驗(yàn)結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)菌株對(duì)亞胺培南和厄他培南的MIC 值在4-32μg / ml，所有實(shí)驗(yàn)菌株對(duì)三代頭孢菌素均耐藥。硼酸抑制試驗(yàn)有5 株陽性結(jié)果，改良Hodge 試驗(yàn)有4株陽性結(jié)果。PCR 檢測(cè)blaKPC 結(jié)果顯示有2 株菌株攜帶blaKPC-2。PCR檢測(cè)顯示膜孔蛋白OmpK35 編碼基因缺失。接合試驗(yàn)、質(zhì)粒電泳、southernblot 試驗(yàn)顯示blaKPC-2 是由一個(gè)50kb 大小的可接合性

4、質(zhì)粒攜帶，等電聚焦電泳顯示實(shí)驗(yàn)菌與接合菌都有pI6.7的β-內(nèi)酰胺酶。實(shí)驗(yàn)菌株在RNAi前后亞胺培南和厄他培南的MIC 值都是32μg / ml。 結(jié)論：1.在上海數(shù)家醫(yī)院2005-2006年的臨床分離株中共檢測(cè)到2株產(chǎn)KPC-2的腸桿菌科細(xì)菌，說明KPC酶的發(fā)生率還比較低。硼酸抑制試驗(yàn)的敏感性要高于改良Hodge試驗(yàn)，陽性結(jié)果需要繼續(xù)檢測(cè)blaKPC。2.PCR檢測(cè)blaKPC和膜孔蛋白編碼基因結(jié)果證明，肺炎克雷伯菌對(duì)碳青霉烯