支持細胞條件培養(yǎng)基對精原干細胞增殖與凋亡影響的研究.pdf

1、精原干細胞可以維持自身的增殖以及分化為不同的生殖細胞，是自然狀態(tài)下出生后個體內(nèi)在整個生命期間能夠進行自增殖并能將基因傳遞至子代的惟一成體干細胞。精原干細胞的體外培養(yǎng)是研究生精過程及其影響因素的重要手段，優(yōu)化精原細胞的培養(yǎng)條件、規(guī)范細胞培養(yǎng)程序、闡明精原細胞在體外培養(yǎng)中細胞數(shù)量、細胞增殖、細胞凋亡等生物學(xué)特性的變化規(guī)律，是進一步深入研究的重要基礎(chǔ)。但是精原干細胞在體外存活和增殖受到許多因素的影響，體外培養(yǎng)的條件以及某些基因方面的研究還不是

2、十分明了，因此，有必要對精原干細胞的體外培養(yǎng)體條件以及其對增殖、凋亡相關(guān)基因表達的影響作一下研究。
　　 本實驗采用組合酶消化、選擇性貼壁的方法，分離得到了純度較高的小鼠睪丸精原干細胞；并設(shè)計了條件培養(yǎng)基、GDNF處理培養(yǎng)基以及對照培養(yǎng)基三種體系培養(yǎng)精原細胞。在一定的時間內(nèi)培養(yǎng)精原細胞，應(yīng)用CASY細胞活力分析儀、激光共聚焦顯微鏡等技術(shù)檢測了精原干細胞數(shù)量及活性，精原干細胞標志物c-kit受體蛋白，并輔助以堿性磷酸酶染色鑒定；檢

3、測細胞增殖核抗原（PCNA）和Bcl-2家族蛋白Bax（Homo sapiens Bcl-2 associated protein）、Bcl-2(B-cell leulcemia-lymphoma 2)的表達變化。
　　 實驗結(jié)果顯示：
　　 1.應(yīng)用組合酶消化、選擇性貼壁分離純化的方法，分離得到的小鼠精原細胞的純度達到70％以上。
　　 2.應(yīng)用細胞活力分析儀測定細胞培養(yǎng)過程的數(shù)量及活性，表明細胞在體外培養(yǎng)時期

4、，細胞的增殖高峰分別在培養(yǎng)的第三天以及第七天，其中條件培養(yǎng)基組細胞增殖數(shù)量高于GDNF處理組；在培養(yǎng)的第七天，GDNF處理組與對照組相差不大。
　　 3.應(yīng)用堿性磷酸酶染色及c-kit受體蛋白檢測方法鑒定了培養(yǎng)的精原干細胞。
　　 4.激光共聚焦顯微鏡檢測結(jié)果顯示，在培養(yǎng)的第一天，條件培養(yǎng)基組Bax、Bcl-2、PCNA的表達與GDNF處理組相差不大；條件培養(yǎng)基組和GDNF處理組與對照組相比，Bax的信號較弱，Bcl-2

5、的信號較強；PCNA信號較強。說明在培養(yǎng)的初期條件培養(yǎng)基組與GDNF處理組差別不大，培養(yǎng)狀態(tài)均好于對照組。
　　 5.在培養(yǎng)的第三天，條件培養(yǎng)基與GDNF處理組Bax的表達低于對照組，條件培養(yǎng)基與GDNF處理組差別不大；條件培養(yǎng)基組Bcl-2的表達高于GDNF處理組，GDNF處理組高于對照組；條件培養(yǎng)基組PCNA的表達高于高于GDNF處理組，GDNF處理組高于對照組。說明在增殖的第一個高峰，條件培養(yǎng)基組培養(yǎng)狀態(tài)好于GDNF處理組

6、與對照組，GDNF處理組好于對照組。
　　 6.在培養(yǎng)的第五天，條件培養(yǎng)基組、GDNF處理組、對照組Bax的表達差異不大，保持在較高的水平；條件培養(yǎng)基組Bcl-2的表達高于GDNF處理組，GDNF處理組高于對照組；條件培養(yǎng)基組的PCNA的表達高于GDNF處理組和對照組，GDNF處理組和對照組差異不大。說明在培養(yǎng)的第五天，三組細胞均處于高凋亡率時期，細胞數(shù)量處于最低，但條件培養(yǎng)基組增殖情況好于GDNF處理組與對照組。
　　

7、 7.在培養(yǎng)的第七天，條件培養(yǎng)基組Bax的表達低于GDNF處理組與對照組，條件培養(yǎng)基組與GDNF處理組表達差異不大；條件培養(yǎng)基組Bcl-2的表達高于GDNF處理組和對照組，GDNF處理組與對照組差異不大；條件培養(yǎng)基組PCNA的表達高于GDNF處理組與對照組，GDNF處理組與對照組差異不大。說明在第二個增殖高峰，條件培養(yǎng)基組仍保持較高的增殖水平，且凋亡率不高；而GDNF處理組和對照組增增水平相近，且處于較高的凋亡水平。
　　 以上