KLF6基因表達(dá)下調(diào)在腎透明細(xì)胞癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的:腎細(xì)胞癌是泌尿系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性疾病之一，在所有的泌尿系統(tǒng)腫瘤中，腎癌的發(fā)生率和死亡率為第二位。腎透明細(xì)胞癌是腎細(xì)胞癌中最常見(jiàn)的病理類型，對(duì)放化療不敏感，臨床上缺乏有效的預(yù)測(cè)指標(biāo)及治療靶點(diǎn)。前期芯片結(jié)果提示在轉(zhuǎn)移性腎透明細(xì)胞癌原發(fā)灶腫瘤組織中轉(zhuǎn)錄因子KLF6的表達(dá)下調(diào)，E2F1的表達(dá)升高。因此本課題探討了KLF6和E2F1在腎透明細(xì)胞癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移中的作用和可能的作用機(jī)制。
　　方法:①將配對(duì)的4例原發(fā)轉(zhuǎn)移性腎透明細(xì)胞癌以及5例原

2、發(fā)未轉(zhuǎn)移腎透明細(xì)胞癌組織樣本，使用Affymetrix Human Genome U133 Plus2.0 Array進(jìn)行mRNA微陣列芯片篩選。t檢驗(yàn)篩選分組間具有明顯表達(dá)差異的基因(P＜0.05)。隨后利用實(shí)時(shí)定量PCR和western blot在擴(kuò)大的樣本量中檢測(cè)差異基因KLF6 mRNA表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平，驗(yàn)證芯片結(jié)果。②腎癌細(xì)胞系（769-P，786-O，Caki-2，以及OS-RC-2）的體外實(shí)驗(yàn)研究KLF6對(duì)細(xì)胞增殖、

3、侵襲、遷移等生物學(xué)功能的影響。③基于生物信息學(xué)Gene Set Enrichment Analysis(GESA)分析可能的促進(jìn)腎透明細(xì)胞癌發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵基因。對(duì)關(guān)鍵因子E2F1啟動(dòng)子區(qū)域的高級(jí)分析及預(yù)測(cè)，計(jì)算編碼基因集合與轉(zhuǎn)錄因子/染色質(zhì)調(diào)控復(fù)合物的靶基因集合的交集，利用計(jì)算該交集的富集程度，得到與E2F1顯著相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，尋找KLF6與E2F1表達(dá)調(diào)控相關(guān)的作用機(jī)制。④建立裸鼠腎臟原位和轉(zhuǎn)移腫瘤模型，利用分子顯像系統(tǒng)活體監(jiān)測(cè)K

4、LF6與E2F1對(duì)腫瘤生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移的影響。⑤組織標(biāo)本中檢測(cè)KLF6以及E2F1與臨床資料及隨訪結(jié)果的相關(guān)性分析。
　　結(jié)果:①在擴(kuò)大的樣本量（轉(zhuǎn)移性VS非轉(zhuǎn)移性腎透明細(xì)胞癌）組織中檢測(cè)KLF6 mRNA和蛋白的表達(dá)。結(jié)果表明KLF6 mRNA和蛋白水平在原發(fā)性轉(zhuǎn)移組中下調(diào)，證實(shí)了芯片檢測(cè)的結(jié)果。②MTS以及細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明KLF6能抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，降低腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。③在腎透明細(xì)胞癌中，KLF6能夠通過(guò)結(jié)合E

5、2F1啟動(dòng)子區(qū)域抑制E2F1的轉(zhuǎn)錄，繼而下調(diào)E2F1的表達(dá)。④在腎癌細(xì)胞系中KLF6表達(dá)下調(diào)能促進(jìn)E2F1基因的表達(dá)上調(diào)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生EMT，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲遷移。⑤裸鼠原位腎腫瘤和肺轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，原位種植穩(wěn)定敲低KLF6的786-O細(xì)胞株與對(duì)照組相比，腫瘤體積明顯增大，肺部轉(zhuǎn)移灶的形成顯著增多，而敲低E2F1表達(dá)，能夠逆轉(zhuǎn)以上促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的過(guò)程。⑥對(duì)114例腎透明細(xì)胞癌患者臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析，發(fā)現(xiàn)KLF6的mRNA表達(dá)下

6、調(diào)和腎腫瘤T分期是腎透明細(xì)胞癌發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。隨訪和生存分析結(jié)果表明腎癌組織KLF6低表達(dá)和E2F1高表達(dá)的患者預(yù)后不良。
　　結(jié)論:①轉(zhuǎn)錄因子KLF6表達(dá)下調(diào)可能與腎透明細(xì)胞癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移有關(guān)。②KLF6在腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞系中抑制增殖，降低細(xì)胞侵襲力。③腎透明細(xì)胞癌中KLF6能負(fù)向調(diào)控E2F1并能通過(guò)影響EMT相關(guān)下游靶基因來(lái)促進(jìn)腎透明細(xì)胞癌的惡性進(jìn)展和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。④KLF6低表達(dá)是腎透明細(xì)胞癌患者發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的獨(dú)立危