棉花GhMAPKKK42響應(yīng)環(huán)境脅迫并參與植物的生長發(fā)育過程.pdf

1、促絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)是一類存在于各種真核生物體中的絲氨酸/蘇氨酸型蛋白激酶，通過保守的三級(jí)級(jí)聯(lián)反應(yīng)(MAPKKK-MAPKK-MAPK)，接受外界刺激信號(hào)，并將細(xì)胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi)。MAPK級(jí)聯(lián)途徑普遍存在于動(dòng)物、植物和酵母系統(tǒng)中，當(dāng)植物遭受外界生物或非生物脅迫時(shí)，MAPK級(jí)聯(lián)途徑就會(huì)被啟動(dòng)，這些脅迫包括:干旱、高鹽、低溫、機(jī)械損傷、病原體侵染及活性氧脅迫等

2、。到目前為止，關(guān)于MAPK家族成員的報(bào)道主要集中在MAPK和MAPKK家族的成員，而對MAPKKK的研究相對有限，尤其是在重要的經(jīng)濟(jì)作物棉花中，對MAPKKK的研究幾乎沒有。棉花是我國重要的產(chǎn)纖維和油料的經(jīng)濟(jì)作物，本研究以陸地棉（Gossypium hirsutumL.）（魯棉22）為實(shí)驗(yàn)材料，利用同源克隆的方法分離出一個(gè)新的MAPKKK基因（GhMAPKKK42），并對其進(jìn)行了序列分析、表達(dá)模式分析及生物學(xué)功能分析，具體研究結(jié)果如下:

3、
　　(1)通過同源克隆的方法獲得了全長1558bp的cDNA片段，其中包括215bp的5' UTR(untranslated region)，218bp的3'UTR以及1125bp的開放閱讀框(open readingframe，ORF)。ORF編碼一個(gè)含有374個(gè)氨基酸，等電點(diǎn)為8.89，分子質(zhì)量為42.573kDa的多肽。通過氨基酸序列分析以及聚類分析發(fā)現(xiàn)，該氨基酸序列含有一個(gè)C端激酶結(jié)構(gòu)域并與RAF亞族的氨基酸序列有較高的

4、同源性，因此，我們推斷該基因?qū)儆贛APKKK家族的RAF亞族，命名為GhMAPKKK42。通過亞細(xì)胞定位分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白定位于細(xì)胞核內(nèi)，因此推測其可能在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)功能。
　　(2)通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)的方法對棉花遭受外界環(huán)境脅迫時(shí)的表達(dá)模式進(jìn)行分析，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在低溫(4℃)、機(jī)械損傷和信號(hào)分子赤霉素(GA3)、萘乙酸(NAA)的處理下，GhMAPKKK42的表達(dá)量上調(diào);在干旱、高鹽、青枯勞爾氏菌（R

5、.solanacearum）、立枯絲核菌（R.Solani）和信號(hào)分子茉莉酸甲酯(MeJA)、脫落酸(ABA)的處理下，GhMAPKKK42的表達(dá)量下調(diào)，說明GhMAPKKK42響應(yīng)各種生物及非生物脅迫以及信號(hào)分子的調(diào)節(jié)。
　　(3)利用hi-TAIL PCR的方法獲得了基因GhMAPKKK42長1104bp的啟動(dòng)子序列，通過Plantcare軟件對該序列進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，該啟動(dòng)子序列中含有與溫度相關(guān)的作用元件LTR和HSE，響

6、應(yīng)信號(hào)分子GA的作用元件GARE-motif和P-box，還有與組織發(fā)育相關(guān)的作用元件GCN4_motif和as-2-box，說明GhMAPKKK42可能參與調(diào)控溫度脅迫并參與植物的生長發(fā)育過程。
　　(4)對超表達(dá)轉(zhuǎn)基因煙草植株進(jìn)行功能分析發(fā)現(xiàn)，在干旱和鹽處理下，超表達(dá)植株的種子萌發(fā)率低于野生型煙草種子，通過檢測相關(guān)抗氧化酶基因的表達(dá)量發(fā)現(xiàn)干旱和高鹽處理后，轉(zhuǎn)基因植株內(nèi)相關(guān)抗氧化酶基因的表達(dá)量降低，其清除活性氧的能力減弱，說明轉(zhuǎn)

7、基因植株對干旱和高鹽處理敏感;病原菌侵染葉片后，轉(zhuǎn)基因煙草的葉片上有較大的黃斑面積和較多的H2O2積累，通過檢測相關(guān)抗病基因的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)抗病基因PR1c、 PR2和PR4的表達(dá)量下降，說明轉(zhuǎn)基因煙草植株對青枯菌敏感，而且與相關(guān)抗病基因的表達(dá)有關(guān);在低溫處理下，轉(zhuǎn)基因植株受到的傷害程度較輕，并且轉(zhuǎn)基因植株內(nèi)有較少的丙二醛(MDA)和較多的可溶性糖積累，相關(guān)抗氧化酶的活性也比野生型煙草高，說明轉(zhuǎn)基因植株在低溫(4℃)處理下表現(xiàn)為抗性。