RNA干擾沉默PDGF-D基因對胃癌細胞SGC-7901影響的實驗研究.pdf

1、第一部分 PDGF-D和VEGF在胃癌中的表達及臨床意義
　　 目的：探討血小板源性生長因子D（Platelet-derived growthfactor-D，PDGF-D）和血管內皮生長因子（Vascular endothelial growthfactor，VEGF）在胃癌中的表達及其與胃癌臨床病理特征的關系。
　　 方法：用免疫組織化學（SP法）檢測組織中PDGF-D和VEGF蛋白的表達，用逆轉錄多聚酶鏈反應（RT

2、-PCR）對其中的40例胃癌組織標本進行PDGF-D和VEGF mRNA的半定量分析，分析兩者之間的相關性及其與臨床病理特征之間的關系。
　　 結果：胃癌組織中PDGF-D和VEGF蛋白的表達顯著高于癌旁組織和正常胃組織（P<0.05）；PDGF-D和VEGF的表達與胃癌的TNM分期、浸潤深度及淋巴結轉移有關（P<0.05），PDGF-D的表達還與胃癌的分化程度有關（P<0.05）；PDGF-D和VEGF在mRNA水平和蛋白水平

3、的表達均呈正相關（均P<0.05）。
　　 結論：PDGF-D和VEGF在胃癌組織中特異性高表達，可能在胃癌的發(fā)生、發(fā)展與轉移中起著重要作用。
　　 第二部分 RNA干擾抑制SGC-7901細胞PDGF-D表達的研究
　　 目的：構建PDGF-D的shRNA質粒載體，檢測其在胃癌細胞株SGC-7901中對PDGF-D表達的抑制作用，并篩選出其穩(wěn)定表達細胞株。
　　 方法：設計合成兩條針對靶基因（PDGF-

4、DmRNA）的干擾序列和陰性對照序列，連接至pGPU6/GFP/Neo載體上，分別轉染至胃癌細胞株SGC-7901，RT-PCR和Western Blot檢測干擾后胃癌細胞株SGC-7901的PDGF-DmRNA和PDGF-D蛋白表達量，篩選出抑制效率高的質粒，用G418篩選出穩(wěn)定表達干擾序列的胃癌細胞株。
　　 結果：酶切電泳分析和DNA測序證實成功構建PDGF-D-shRNA質粒，轉染48小時后與未處理組和陰性對照組相比，P

5、DGF-D-shRNA1，PDGF-D-shRNA2重組載體均能使SGC-7901細胞中PDGF-D基因在mRNA和蛋白水平上的表達明顯下調（P<0.05），且后者抑制效果更好；其抑制率在mRNA和蛋白水平分別達68.2％，1165.2％（P<0.05）。并成功篩選出穩(wěn)定表達的胃癌細胞株。
　　 結論：構建的重組質粒PDGF-D-shRNA2能有效抑制PDGF-D基因在胃癌細胞中表達，且成功篩選出其穩(wěn)定表達細胞株，為下一步研究打

6、下基礎。
　　 第三部分 RNA干擾下調PDGF-D表達對胃癌SGC-7901的生物學特性的影響及其機制的研究
　　 目的：研究下調胃癌細胞SGC-7901的PDGF-D表達對其體外增殖、粘附、遷移、侵襲、血管形成的影響及其機制。
　　 方法：分別檢測PDGF-D下調前后的胃癌細胞SGC-7901生物學特性的變化，MTT法檢測細胞增殖，流式細胞檢測細胞周期，粘附實驗檢測細胞粘附力，劃痕實驗檢測細胞遷移，Trans

7、well小室檢測細胞侵襲，以及對臍靜脈血管內皮細胞的管狀結構形成的影響；利用WesternBlot和ELISA法檢測與PDGF-D相關信號通路的因子表達的變化。
　　 結果：下調PDGF-D的表達后，胃癌細胞SGC-7901的增殖、粘附、遷移、侵襲、血管形成都受到一定程度的抑制（P<0.05）；細胞周期分析發(fā)現，S期細胞減少，而G0/G1期細胞增加（P<0.05）；Cyclin D1、MMP-2、MMP-9、VEGF蛋白和核內的

8、β-catenin表達下調（P<0.05），其培養(yǎng)液上清的VEGF濃度也有明顯的下降（P<0.05）。
　　 結論：下調PDGF-D的表達對胃癌細胞SGC-7901的體外增殖、粘附、遷移、侵襲、血管形成有明顯抑制作用，其機制可能和PDGF-D下調后使核內的β-catemn表達下調進而使得其下游的Cyclin D1、MMP-2、MMP-9、VEGF蛋白表達下降有關。
　　 第四部分RNA干擾PDGF-D表達對SGC-790

9、1細胞裸鼠移植瘤生長和血管形成研究
　　 目的：觀察下調胃癌SGC-7901的PDGF-D的表達對裸鼠移植瘤的生長和血管形成的影響。
　　 方法：通過裸鼠的移植瘤模型觀察下調PDGF-D表達后胃癌細胞在裸鼠體內的生長情況，觀測其對移植瘤生長的影響，Western Blot檢測移植瘤內PDGF-D和VEGF的變化，檢測組織微血管密度的變化。
　　 結果：發(fā)現PDGF-D下調的胃癌SGC-7901細胞裸鼠移植瘤生長緩