RNA干擾沉默PDGF-D基因?qū)ξ赴┘?xì)胞SGC-7901影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分 PDGF-D和VEGF在胃癌中的表達(dá)及臨床意義
　　 目的：探討血小板源性生長因子D（Platelet-derived growthfactor-D，PDGF-D）和血管內(nèi)皮生長因子（Vascular endothelial growthfactor，VEGF）在胃癌中的表達(dá)及其與胃癌臨床病理特征的關(guān)系。
　　 方法：用免疫組織化學(xué)（SP法）檢測組織中PDGF-D和VEGF蛋白的表達(dá)，用逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)（RT

2、-PCR）對其中的40例胃癌組織標(biāo)本進(jìn)行PDGF-D和VEGF mRNA的半定量分析，分析兩者之間的相關(guān)性及其與臨床病理特征之間的關(guān)系。
　　 結(jié)果：胃癌組織中PDGF-D和VEGF蛋白的表達(dá)顯著高于癌旁組織和正常胃組織（P<0.05）；PDGF-D和VEGF的表達(dá)與胃癌的TNM分期、浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P<0.05），PDGF-D的表達(dá)還與胃癌的分化程度有關(guān)（P<0.05）；PDGF-D和VEGF在mRNA水平和蛋白水平

3、的表達(dá)均呈正相關(guān)（均P<0.05）。
　　 結(jié)論：PDGF-D和VEGF在胃癌組織中特異性高表達(dá)，可能在胃癌的發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)移中起著重要作用。
　　 第二部分 RNA干擾抑制SGC-7901細(xì)胞PDGF-D表達(dá)的研究
　　 目的：構(gòu)建PDGF-D的shRNA質(zhì)粒載體，檢測其在胃癌細(xì)胞株SGC-7901中對PDGF-D表達(dá)的抑制作用，并篩選出其穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株。
　　 方法：設(shè)計(jì)合成兩條針對靶基因（PDGF-

4、DmRNA）的干擾序列和陰性對照序列，連接至pGPU6/GFP/Neo載體上，分別轉(zhuǎn)染至胃癌細(xì)胞株SGC-7901，RT-PCR和Western Blot檢測干擾后胃癌細(xì)胞株SGC-7901的PDGF-DmRNA和PDGF-D蛋白表達(dá)量，篩選出抑制效率高的質(zhì)粒，用G418篩選出穩(wěn)定表達(dá)干擾序列的胃癌細(xì)胞株。
　　 結(jié)果：酶切電泳分析和DNA測序證實(shí)成功構(gòu)建PDGF-D-shRNA質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染48小時(shí)后與未處理組和陰性對照組相比，P

5、DGF-D-shRNA1，PDGF-D-shRNA2重組載體均能使SGC-7901細(xì)胞中PDGF-D基因在mRNA和蛋白水平上的表達(dá)明顯下調(diào)（P<0.05），且后者抑制效果更好；其抑制率在mRNA和蛋白水平分別達(dá)68.2％，1165.2％（P<0.05）。并成功篩選出穩(wěn)定表達(dá)的胃癌細(xì)胞株。
　　 結(jié)論：構(gòu)建的重組質(zhì)粒PDGF-D-shRNA2能有效抑制PDGF-D基因在胃癌細(xì)胞中表達(dá)，且成功篩選出其穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，為下一步研究打

6、下基礎(chǔ)。
　　 第三部分 RNA干擾下調(diào)PDGF-D表達(dá)對胃癌SGC-7901的生物學(xué)特性的影響及其機(jī)制的研究
　　 目的：研究下調(diào)胃癌細(xì)胞SGC-7901的PDGF-D表達(dá)對其體外增殖、粘附、遷移、侵襲、血管形成的影響及其機(jī)制。
　　 方法：分別檢測PDGF-D下調(diào)前后的胃癌細(xì)胞SGC-7901生物學(xué)特性的變化，MTT法檢測細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞檢測細(xì)胞周期，粘附實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞粘附力，劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移，Trans

7、well小室檢測細(xì)胞侵襲，以及對臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的管狀結(jié)構(gòu)形成的影響；利用WesternBlot和ELISA法檢測與PDGF-D相關(guān)信號通路的因子表達(dá)的變化。
　　 結(jié)果：下調(diào)PDGF-D的表達(dá)后，胃癌細(xì)胞SGC-7901的增殖、粘附、遷移、侵襲、血管形成都受到一定程度的抑制（P<0.05）；細(xì)胞周期分析發(fā)現(xiàn)，S期細(xì)胞減少，而G0/G1期細(xì)胞增加（P<0.05）；Cyclin D1、MMP-2、MMP-9、VEGF蛋白和核內(nèi)的

8、β-catenin表達(dá)下調(diào)（P<0.05），其培養(yǎng)液上清的VEGF濃度也有明顯的下降（P<0.05）。
　　 結(jié)論：下調(diào)PDGF-D的表達(dá)對胃癌細(xì)胞SGC-7901的體外增殖、粘附、遷移、侵襲、血管形成有明顯抑制作用，其機(jī)制可能和PDGF-D下調(diào)后使核內(nèi)的β-catemn表達(dá)下調(diào)進(jìn)而使得其下游的Cyclin D1、MMP-2、MMP-9、VEGF蛋白表達(dá)下降有關(guān)。
　　 第四部分RNA干擾PDGF-D表達(dá)對SGC-790

9、1細(xì)胞裸鼠移植瘤生長和血管形成研究
　　 目的：觀察下調(diào)胃癌SGC-7901的PDGF-D的表達(dá)對裸鼠移植瘤的生長和血管形成的影響。
　　 方法：通過裸鼠的移植瘤模型觀察下調(diào)PDGF-D表達(dá)后胃癌細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的生長情況，觀測其對移植瘤生長的影響，Western Blot檢測移植瘤內(nèi)PDGF-D和VEGF的變化，檢測組織微血管密度的變化。
　　 結(jié)果：發(fā)現(xiàn)PDGF-D下調(diào)的胃癌SGC-7901細(xì)胞裸鼠移植瘤生長緩