線粒體基因組complexⅠ變異與甲狀腺腫瘤相關(guān)性研究.pdf

1、目的:
　　 1、本研究通過直接測序的方法檢測溫州地區(qū)甲狀腺腫瘤患者線粒體DNAcomplexⅠ變異發(fā)生情況。
　　 2、分析線粒體DNA complexⅠ突變與甲狀腺腫瘤的相關(guān)性及其在甲狀腺腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用。
　　 方法:
　　 1、標本采集:選取2008年9月至2009年7月期間在溫州醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院就診的甲狀腺腫瘤患者80例,包括甲狀腺惡性腫瘤60例(甲狀腺乳頭狀癌59例和甲狀腺濾泡狀癌1例)

2、和甲狀腺良性腫瘤20例(其中有1例石蠟病理論斷為腺瘤型結(jié)節(jié)性甲狀腺腫,其它19例為甲狀腺腺瘤)。采集所選患者經(jīng)蘇木素-伊紅(HE)染色的5μm手術(shù)冰凍病理切片3張,同時采集患者的外周靜脈血標本及其臨床資料。
　　 2、DNA提取:光學顯微鏡下觀察病理冰凍組織切片,區(qū)分腫瘤組織和腫瘤旁正常組織。用試劑盒法提取血液標本的全基因組DNA,蛋白酶K法提取腫瘤組織和腫瘤旁組織的全基因組DNA。
　　 3、PCR擴增:設(shè)計11對互相

3、交叉的引物對線粒體DNA complexⅠ進行PCR擴增,PCR產(chǎn)物直接進行測序。
　　 4、數(shù)據(jù)分析:以患者自身的外周靜脈血序列為對照,應(yīng)用軟件Codoncode Aligner對測序結(jié)果進行線粒體DNA complexⅠ變異情況分析。進一步分析氨基酸改變并運用生物軟件進行保守性分析,借助蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫對二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測,探討complexⅠ突變致瘤的分子機制。
　　 5、統(tǒng)計學分析:結(jié)合患者臨床資料,通過統(tǒng)計學方法分析

4、其與線粒體DNAcomplexⅠ突變的相關(guān)性,初步探討線粒體DNA complexⅠ突變在甲狀腺腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用。
　　 結(jié)果:
　　 1、本研究共檢測到20個線粒體DNA complexⅠ突變,14個為同質(zhì)性突變(70％),6個為異質(zhì)性突變(30％),其中觀察到2個突變位點從血液到腫瘤旁組織,再到腫瘤組織異質(zhì)率變化,即由野生型向突變型的轉(zhuǎn)變過程。
　　 2、本研究在60例惡性腫瘤患者中的17例檢測到突變(突

5、變率為28.33％),在20例良性腫瘤患者中的2例檢測到突變(突變率為10％),對惡性腫瘤組和良性腫瘤組兩組突變率進行統(tǒng)計學分析,結(jié)果無統(tǒng)計學差異(P值>0.05)。
　　 3、在20個突變位點中,2個(包括G3842A和G4974A)為無義突變,5個為移碼突變,13個為錯義突變。錯義突變中7個引起氨基酸極性改變,且多位于進化上保守的位置,對二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測,發(fā)現(xiàn)C13250T引起了其編碼多肽二級結(jié)構(gòu)的改變,對無義突變和移碼突變

6、的二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測,發(fā)現(xiàn)也引起了多肽二級結(jié)構(gòu)的改變。
　　 4、檢測到的突變位點在complexⅠ的分布情況為ND1基因4個、ND2基因2個、ND3基因1個、ND4L基因1個、ND4基因6個、ND5基因5個、ND6基因1個。堿基改變情況,2個為堿基顛換(包括T-G和C-A顛換各1個),13個為堿基轉(zhuǎn)換(包括G-A轉(zhuǎn)換8個,T-C轉(zhuǎn)換4個,C-T轉(zhuǎn)換1個)。
　　 5、在complexⅠ上共發(fā)現(xiàn)203個多態(tài)性位點,其中19

7、7個位點(97.04％)為堿基之間的轉(zhuǎn)換(包括55個A-G,50個G-A,43個T-C,49個C-T),6個為堿基之間的顛換(包括3個C-A,1個T-A,1個T-G,1個G-C),其中有8個為未報道的。
　　 6、線粒體DNA GomplexⅠ突變與甲狀腺腫瘤患者的性別、年齡、家族史、腫瘤大小以及甲狀腺功能指標(促甲狀腺素、游離甲狀腺素和游離三碘甲狀腺原氨酸)均無統(tǒng)計學意義(所有p值均>0.05)。
　　 結(jié)論:

8、　　 1、在本研究發(fā)現(xiàn)的突變位點中,觀察到2個突變位點從血液到腫瘤旁組織,再到腫瘤組織異質(zhì)率變化,即由野生型向突變型的轉(zhuǎn)變過程,以現(xiàn)有數(shù)據(jù)來看,可初步認為線粒體DNA突變參與甲狀腺腫瘤的發(fā)生。
　　 2、在本研究樣本例數(shù)(包括60例惡性和20例良性甲狀腺腫瘤)和地域(溫州地區(qū))范圍內(nèi),線粒體DNA complexⅠ突變在惡性腫瘤組和良性腫瘤組兩組間的突變率無統(tǒng)計學差異(p值>0.05),但檢測到的錯義突變C13250T、移碼突