分娩性臂叢麻痹失神經(jīng)肌肉萎縮基因調(diào)控特征的基礎(chǔ)研究.pdf

1、第一部分手內(nèi)肌萎縮速度快于上肢大肌肉的大鼠模型建立
　　目的：在分娩性臂叢麻痹的臨床病例中，神經(jīng)修復(fù)手術(shù)對于手內(nèi)肌的效果遠(yuǎn)不及上臂大肌肉。失神經(jīng)肌肉發(fā)生不可逆萎縮后，即使神經(jīng)再生非常成功，也難以恢復(fù)形態(tài)和收縮功能。在分娩性臂叢麻痹臨床診治的證據(jù)表明，手內(nèi)肌進(jìn)入的不可逆萎縮速度要遠(yuǎn)大于上肢大肌肉，這提示手內(nèi)肌失神經(jīng)肌萎縮過程中的自我調(diào)節(jié)機(jī)制可能不同于肱二頭肌。本部分實(shí)驗(yàn)的目的是建立臨床上失神經(jīng)后手內(nèi)肌萎縮速度快于上肢大肌肉的大鼠模型

2、，以闡明兩種肌肉對手術(shù)時(shí)機(jī)敏感性不同的形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)，為進(jìn)一步基因研究提供理想的動物模型。
　　方法：將64只新生大鼠模擬臨床上分娩性臂叢麻痹的常見類型建立模型——C5C6斷裂和C7C8T1撕脫，并將其平均分為重建組和對照組。對于重建組，在神經(jīng)損傷術(shù)后1、5、10、15周后分別取8只大鼠行尺神經(jīng)和肌皮神經(jīng)的修復(fù)手術(shù)，依次分為R1、R5、R10、R15亞組，對大鼠行神經(jīng)移植修復(fù)術(shù):C6→尺神經(jīng)，C5→肌皮神經(jīng)方式修復(fù)神經(jīng)，并且使用2股腓

3、腸神經(jīng)移植，于術(shù)后12周取材分析。而在對照組，則在神經(jīng)損傷術(shù)后1、5、10、15周后分別取8只大鼠直接取材分析，依次分為C1、C5、C10、C15亞組。之后對大鼠進(jìn)行1）神經(jīng)傳導(dǎo)研究:對重建組大鼠，分別暴露兩側(cè)肌皮神經(jīng)和尺神經(jīng)以及前肢相應(yīng)的待檢肱二頭肌和爪內(nèi)肌，記錄兩側(cè)潛伏期及誘發(fā)肌電位的波幅。2）有髓神經(jīng)纖維計(jì)數(shù):將飼養(yǎng)12周后的32只實(shí)驗(yàn)組大鼠進(jìn)行有髓神經(jīng)纖維計(jì)數(shù)分析:取雙側(cè)腕部為尺神經(jīng)取材點(diǎn)，肱二頭肌入肌點(diǎn)處為肌皮神經(jīng)取材點(diǎn)，通過

4、圖像分析軟件計(jì)算有髓神經(jīng)軸突的數(shù)量。3）肌肉組織形態(tài)學(xué)分析:每只大鼠的雙側(cè)肱二頭肌和爪內(nèi)肌均在手術(shù)操作顯微鏡下取出，均行HE染色，Masson三色染色和TUNEL染色，分別用以觀察肌肉萎縮，纖維增生和凋亡的情況。利用圖像分析軟件，測量肌纖維的平均截面積，并與左側(cè)肌肉的該數(shù)值進(jìn)行比較并計(jì)算肌細(xì)胞截面積恢復(fù)率。每張Masson染色切片統(tǒng)計(jì)膠原纖維截面積比。凋亡指數(shù)是予以分析樣本中凋亡的肌細(xì)胞核占所有細(xì)胞核數(shù)量的比例，利用TUNEL細(xì)胞凋亡原

5、位檢測法標(biāo)記切片中的凋亡肌細(xì)胞核，每張切片在20倍物鏡下連續(xù)觀察3-5個(gè)視野，數(shù)至1000個(gè)細(xì)胞核中凋亡細(xì)胞核所占的比例即為凋亡指數(shù)(AI，％)。每組數(shù)據(jù)根據(jù)分布以中位數(shù)（四分位區(qū)間）或均值士標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。采用Mann-Whitney U test來分析組間差異，所有值的概率都為雙尾，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異設(shè)定為0.05。
　　結(jié)果 ：R1、R5亞組中，尺神經(jīng)和肌皮神經(jīng)的復(fù)合肌肉動作電位均能測出。R10亞組中，肌皮神經(jīng)仍可測出復(fù)合肌肉動作

6、電位，而尺神經(jīng)已無法測出。尺神經(jīng)和肌皮神經(jīng)在R15亞組內(nèi)均無法測出復(fù)合動作電位。在重建組中，大鼠右側(cè)上肢尺神經(jīng)有髓神經(jīng)纖維數(shù)與上左側(cè)正常尺神經(jīng)纖維數(shù)的比值的最小值在R1亞組內(nèi)為85％，R5為70％，R10為73％，R15為53％;對于肌皮神經(jīng)，最小比值在R1亞組內(nèi)為79％，R5為66％，R10為62％，R15為67％。
　　R1亞組前肢爪內(nèi)肌的肌纖維截面積恢復(fù)率明顯優(yōu)于C1亞組，但R5、R10、R15亞組的恢復(fù)率與各自的對照組C5

7、、C10、C15亞組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對于肱二頭肌，R1、R5、R10亞組的肌纖維截面積恢復(fù)率明顯優(yōu)子C1、C5、C10亞組，R15和C15的恢復(fù)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。前肢爪內(nèi)肌的截面積膠原比在R1亞組小于C1亞組，R5、R10、R15各亞組卻與各自的對照組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。R1，R5亞組的肱二頭肌截面積膠原比與C1、C5亞組的差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而R10、R15和C10、C15的恢復(fù)率的差異卻無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。R1和R5亞組的前

8、肢爪內(nèi)肌凋亡指數(shù)分別低于C1和C5亞組，但R10、R15卻與各自對照組C10、C15亞組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對于肱二頭肌，凋亡指數(shù)在R1、R5、R10亞組分別低于C1、C5、C10亞組，但R15和C15之間無明顯差異。凋亡指數(shù)呈在早期上升而到后期又下降的一種變化趨勢。
　　結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了大鼠的產(chǎn)癱模型適用于研究臨床上手內(nèi)肌進(jìn)入不可逆萎縮速度大于上肢大肌肉這一現(xiàn)象。
　　第二部分應(yīng)用基因芯片技術(shù)篩選大鼠前肢爪內(nèi)肌和肱二頭肌

9、在失神經(jīng)肌萎縮過程中的差異表達(dá)基因
　　目的：盡管目前臨床周圍神經(jīng)損傷后的形態(tài)修復(fù)已經(jīng)幾乎達(dá)到完美程度，但是神經(jīng)功能修復(fù)的療效仍然不理想:公認(rèn)恢復(fù)不佳的主要原因之一，是失神經(jīng)肌肉在再生神經(jīng)到達(dá)之前，已經(jīng)發(fā)生不可逆萎縮。但臨床上手內(nèi)肌和上臂大肌肉失神經(jīng)后存在的兩種截然不同的萎縮進(jìn)程卻提示，肌肉中也可能存在影響萎縮速度的因素。
　　骨骼肌肉萎縮的過程中無論是從時(shí)間還是空間上，都存在炎癥、凋亡和重建、再生的反復(fù)交替的過程，而且都是

10、一個(gè)或多個(gè)基因群協(xié)同作用的結(jié)果?；虮磉_(dá)譜芯片可以大規(guī)模檢測生理和各種病理?xiàng)l件下各基因的表達(dá)水平和變化情況，更能從全局的角度了解基因的表達(dá)情況和變化規(guī)律，為全面認(rèn)識基因的功能和基因間的相互關(guān)系提供線索。本次研究的目的是利用基因芯片技術(shù)篩選大鼠前肢爪內(nèi)肌和肱二頭肌在失神經(jīng)肌萎縮過程中的差異表達(dá)基因及相關(guān)的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控模式，為找到影響肌萎進(jìn)程中的關(guān)鍵基因和通路奠定基礎(chǔ)，從而為臨床確立失神經(jīng)肌萎縮進(jìn)入不可逆萎縮狀態(tài)的分子指標(biāo)提供理論基礎(chǔ)。

11、　　方法：選取64只新生7天大鼠行C5—T1全臂叢撕脫，并根據(jù)術(shù)后1、5、10、15周的時(shí)間分為4組，每組16只。在大鼠行肌肉取材前，先進(jìn)行有髓神經(jīng)纖維染色觀察:取腕部為尺神經(jīng)取材點(diǎn)，肱二頭肌入肌點(diǎn)處為肌皮神經(jīng)取材點(diǎn)，盡量選取靠近遠(yuǎn)端的完整神經(jīng)組織，排除神經(jīng)交叉在支配的可能。將每只大鼠雙側(cè)的前肢爪內(nèi)肌和肱二頭肌都取材備用。每個(gè)樣本的總RNA使用NanoDrop ND-1000進(jìn)行定性和定量檢測，瓊脂凝膠電泳檢測其是否符合標(biāo)準(zhǔn)。使用Agi

12、lent微陣列芯片進(jìn)行基因表達(dá)分析，按照標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行的樣品制備和芯片雜交。AgilentFeature Extraction software(version10.7.3.1)進(jìn)行陣列圖像分析。數(shù)據(jù)處理使用的GeneSpring GX v11.5.1軟件(Agilent Technologies)。通過散點(diǎn)圖、火山圖篩選具有統(tǒng)計(jì)意義的差異表達(dá)基因。聚類分析用以分析各樣本間的區(qū)別基因表達(dá)譜。應(yīng)用Pathway和GO分析，以確定這些基因在整

13、個(gè)生物過程中發(fā)揮的功能。最后，篩選出與失神經(jīng)肌萎縮相關(guān)的重點(diǎn)通路和基因。
　　結(jié)果：我們利用基因芯片，對16組32個(gè)樣本進(jìn)行表達(dá)譜分析，結(jié)合生物信息學(xué)和生物統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，我們篩選出了在大鼠前肢爪內(nèi)肌和肱二頭肌失神經(jīng)萎縮后差異表達(dá)的基因;同時(shí)，我們還利用生物信息軟件尋找可能參與失神經(jīng)肌萎縮的生物學(xué)通路，我們鑒別出了一些重要的信號通路，它們很可能在肌纖維萎縮過程中起到了重要的作用。通過基因芯片技術(shù)對大鼠前肢爪內(nèi)肌和肱二頭肌的失神經(jīng)肌萎縮

14、過程進(jìn)行基因表達(dá)譜分析，發(fā)現(xiàn)這兩種肌肉在失神經(jīng)后的存在大量表達(dá)基因和信號通路存在差異:例如前肢爪內(nèi)肌中MLC、MHC基因，TGF3通路中Smad系列基因高表達(dá);肱二頭肌中泛素蛋白酶通路的E1、E2s、E3s等基因高表達(dá)，MAPK通路中的NIK、SRF基因等高表達(dá)。
　　結(jié)論：大鼠前肢爪內(nèi)肌失神經(jīng)后，肌萎進(jìn)程中自我調(diào)控的基因和信號通路較少;且主要以促進(jìn)損傷、凋亡，抑制修復(fù)、再生為主。肱二頭肌失神經(jīng)后，肌萎進(jìn)程中自我調(diào)控的基因和信號通