重組慢病毒介導(dǎo)PPM1B基因轉(zhuǎn)染延緩大鼠失神經(jīng)骨骼肌萎縮的基礎(chǔ)研究.pdf

1、肌萎縮是公認(rèn)的世界疑難病癥，以失神經(jīng)肌萎縮為例，其一旦發(fā)生則呈進(jìn)行性不可逆發(fā)展，目前尚無(wú)有效措施及藥物可完全阻斷這一病程，給患者及其家庭帶來(lái)了沉重的精神和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此，探討失神經(jīng)肌萎縮發(fā)病的分子機(jī)制及尋找新的治療方法顯得尤為重要和迫切。迄今的研究已經(jīng)明確，失神經(jīng)骨骼肌的萎縮是由分子信號(hào)通路掌控，IKKβ/NF-κB通路在其中占有重要的作用。磷酸化的IKKβ去磷酸化與否可能對(duì)失神經(jīng)骨骼肌的發(fā)生發(fā)展有重要意義。依賴鎂/錳離子的蛋白磷酸酶1

2、B(PPM1B)可以使磷酸化的IKKβ的絲氨酸177和絲氨酸181位點(diǎn)發(fā)生去磷酸化，同時(shí)減弱IKKβ的活性。過(guò)表達(dá)PPM1B甚至可以終止由TNF-α誘導(dǎo)的IKKβ/NF-κB通路的活性。基因治療為失神經(jīng)骨骼肌萎縮的防治開(kāi)辟了更廣闊的前景，已有學(xué)者發(fā)現(xiàn)應(yīng)用神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子等基因轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)基因小鼠的方法對(duì)延緩肌萎縮有較好的效果。受此啟發(fā)，本課題嘗試采用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)來(lái)促進(jìn)PPM1B基因過(guò)表達(dá)，使失神經(jīng)肌萎縮的重要通路在上游及時(shí)得到控制

3、，借此來(lái)抑制IKKβ/NF-κB通路的活性，探討其延緩骨骼肌萎縮的療效，為進(jìn)一步研究失神經(jīng)骨骼肌萎縮的分子機(jī)制及針對(duì)該因子的藥物和基因干預(yù)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 第一部分:
　　 PPM1B和P-IKKβ在失神經(jīng)肌萎縮中的達(dá)變化及意義
　　 目的:探討失神經(jīng)骨骼肌萎縮過(guò)程中依賴鎂/錳離子的蛋白磷酸酶1B(PPM1B)和磷酸化的抑制核轉(zhuǎn)錄因子κB激酶β(P-IKKβ)的表達(dá)變化及意義。方法:30只SD大鼠建立右下肢腓

4、腸肌失神經(jīng)支配模型，采用實(shí)時(shí)定量PCR和Westemblot，分別檢測(cè)失神經(jīng)支配第2、7、14和28天的腓腸肌中PPM1BmRNA和蛋白的表達(dá)變化以及P-IKKβ，IKKβ蛋白的表達(dá)變化，并分析PPM1B，P-IKKβ與肌萎縮程度（肌肉濕重維持率）的相關(guān)性。結(jié)果:1、實(shí)時(shí)定量PCR分析結(jié)果顯示PPM1BmRNA的表達(dá)在失神經(jīng)支配后第2天已開(kāi)始下降，迅速降為對(duì)照組的0.41倍，此后表達(dá)水平持續(xù)下降，到第28天時(shí)降為對(duì)照組的0.07倍，各組

5、與對(duì)照組相比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。2、Westernblot灰度分析結(jié)果顯示PPM1B蛋白水平的變化與mRNA水平有著相同的趨勢(shì)，但是變化幅度較轉(zhuǎn)錄水平為低；失神經(jīng)2天表達(dá)水平持續(xù)下降，第7天降為對(duì)照組的0.56倍，到第28天時(shí)降為對(duì)照組的0.24倍。失神經(jīng)術(shù)后第2天與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，第7，14，28天與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）。P-IKKβ蛋白的表達(dá)水平從早期即開(kāi)始增高，失

6、神經(jīng)第2天為對(duì)照組的1.37倍，并隨著失神經(jīng)時(shí)間的推移而呈持續(xù)增加趨勢(shì)，到第28天為對(duì)照組的1.74倍。各組與對(duì)照組相比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。IKKβ蛋白的表達(dá)呈持續(xù)下降的趨勢(shì)，下降幅度較小。各組與對(duì)照組相比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。3、關(guān)聯(lián)性分析顯示PPM1B與P-IKKβ表達(dá)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性(P＜0.01);PPM1B表達(dá)降低與肌濕重比成線性正相關(guān)關(guān)系(P＜0.01)。結(jié)論:在SD大鼠失神經(jīng)骨骼肌萎縮早期，P

7、PM1B的表達(dá)為下調(diào)，P-IKKβ的表達(dá)為上調(diào)；PPM1B和P-IKKβ在失神經(jīng)骨骼肌的表達(dá)強(qiáng)度與肌萎縮密切相關(guān)，二者共同作用參與失神經(jīng)骨骼肌的發(fā)生發(fā)展。采用基因治療促進(jìn)PPM1B基因表達(dá)使其上調(diào)，來(lái)延緩失神經(jīng)骨骼肌萎縮，應(yīng)在失神經(jīng)后越早越好。
　　 第二部分:
　　 PPMIB基因慢病毒載體的構(gòu)建與鑒定
　　 目的:構(gòu)建PPMIB基因重組慢病毒載體，為其體外實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。方法:根據(jù)PPM1B基因的CDS序列，對(duì)

8、大鼠PPM1B基因進(jìn)行ORF克隆，陽(yáng)性克隆經(jīng)菌落PCR驗(yàn)證及測(cè)序驗(yàn)證后，將測(cè)序正確的T-PPM1B進(jìn)行雙酶切，與雙酶切后的pLenti6.3/V5DEST(MCS)-IRES-EGFP相連接，菌落PCR及酶切鑒定篩選出陽(yáng)性克隆，測(cè)序。保留正確的pLenti-EGFP-PPM1B，提純后與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，獲得病毒原液，經(jīng)純化和濃縮后，進(jìn)行測(cè)序分析鑒定。結(jié)果:1、構(gòu)建的慢病毒表達(dá)載體pLenti-EGFP-PPM1B經(jīng)過(guò)測(cè)序驗(yàn)證

9、與GenBank中PPM1B的CDS序列完全一致。2、慢病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞，熒光顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞中有大量明亮的綠色熒光表達(dá)，病毒液的滴度值為1.15×107ifu/ml，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)病毒液中PPM1B基因表達(dá)量是陰性對(duì)照液中的297.48倍。結(jié)論:成功構(gòu)建了PM1B基因慢病毒載體，為下一步體外實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。
　　 第三部分:
　　 重組慢病毒體外促進(jìn)PPMIB的表達(dá)
　　 目的:探討重組慢病毒

10、體外促進(jìn)PPM1B基因表達(dá)的效果，為重組慢病毒介導(dǎo)的失神經(jīng)骨骼肌萎縮基因治療奠定基礎(chǔ)。方法:6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)大鼠成肌細(xì)胞系L6,感染L6細(xì)胞，摸索最佳MOI值。將培養(yǎng)好的L6細(xì)胞分為三組，分別為無(wú)干預(yù)因素的未感染組，感染Lenti-EGFP空載體病毒的對(duì)照組，感染Lenti-IRES2-EGFP-PPM1B的病毒組，進(jìn)行相應(yīng)的感染后72h，取各組細(xì)胞于共聚焦熒光顯微鏡下觀察增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)的表達(dá)、以發(fā)綠色熒光細(xì)胞的平均

11、數(shù)與總細(xì)胞平均數(shù)的比值來(lái)估計(jì)感染的效率、Westernblot檢測(cè)PPM1B蛋白的表達(dá)。結(jié)果:1、慢病毒感染L6大鼠成肌細(xì)胞的MOI值選取MOI=20為最佳。2、病毒組感染后72h，熒光顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞中有大量明亮的綠色熒光表達(dá)，顯示了系統(tǒng)有著較高的感染效率。3、Westernblot灰度分析，感染后72h，病毒組PPM1B基因的蛋白表達(dá)較對(duì)照組和未感染組明顯升高，分別是它們的15.3倍和14.9倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

12、對(duì)照組與未感染組相比，PPM1B蛋白表達(dá)水平無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。結(jié)論:成功驗(yàn)證了重組慢病毒可以促進(jìn)細(xì)胞中PPM1B的蛋白表達(dá)，為下一步在活體內(nèi)研究其功能以及基因靶向治療奠定了基礎(chǔ)。
　　 第四部分:重組慢病毒介導(dǎo)PPMIB基因轉(zhuǎn)染
　　 延緩大鼠失神經(jīng)骨骼肌萎縮
　　 目的:探討重組慢病毒介導(dǎo)的PPM1B基因轉(zhuǎn)染延緩大鼠失神經(jīng)骨骼肌萎縮的療效。方法:將30只SD大鼠，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組15只。

13、切斷坐骨神經(jīng)，建立右下肢失神經(jīng)支配萎縮模型。于實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組失神經(jīng)趾長(zhǎng)伸肌分別感染重組慢病毒載體Lenti-EGFP-PPM1B和Lenti-EGFP溶液50μl(107IU/ml)，轉(zhuǎn)染2、4周，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別取3只大鼠，于共聚焦熒光顯微鏡下觀察增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)的表達(dá)，取6只大鼠，Westernblot檢測(cè)PPM1B、P-IKKβ和IKKβ的表達(dá)；取6只大鼠測(cè)定肌濕重、肌細(xì)胞直徑、肌細(xì)胞橫截面積，并觀察肌纖維超微結(jié)構(gòu)的變

14、化。結(jié)果:慢病毒轉(zhuǎn)染2、4周，兩組趾長(zhǎng)伸肌均可見(jiàn)大量EGFP表達(dá)。Westernblot檢測(cè)顯示實(shí)驗(yàn)組失神經(jīng)趾長(zhǎng)伸肌中均有大量的PPM1B表達(dá)，分別為對(duì)照組的6.8倍與4.9倍（P均＜0.01）。實(shí)驗(yàn)組中P-IKKβ蛋白較對(duì)照組減少，分別為對(duì)照組的45％與62％；實(shí)驗(yàn)組中IKKβ蛋白較對(duì)照組增多，分別為對(duì)照組的4.2倍與2.8倍（P均＜0.05）。轉(zhuǎn)染2周，實(shí)驗(yàn)組肌濕重維持率、肌細(xì)胞直徑和肌細(xì)胞橫截面積分別為(63.28±4.17)％，

15、(30.86±4.24)μm和(880.72±70.54)μm2，均明顯高于對(duì)照組(52.43±3.92)％，(21.39±3.87)μm和(705.27±53.19)μm2;4周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組上述各項(xiàng)指標(biāo)為(45.13±4.95)％，(23.64±3.06)μm和(720.15±38.46)μm2，仍明顯高于對(duì)照組(35.31±4.72)％，(18.66±3.23)μm和(543.67±42.65)μm2（P均＜0.01）。此外，實(shí)驗(yàn)組與