基于piggyBac轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)基因家蠶絲腺表達(dá)Higf-Ⅰ的研究.pdf

1、胰島素樣生長(zhǎng)因子-Ⅰ(human Insulin-like Growth Factor-Ⅰ，hIGF-Ⅰ)是一類具有細(xì)胞分化和增殖功能，并具有胰島素樣作用的多肽。它應(yīng)用的范圍越來(lái)越廣，但是hIGF-Ⅰ供應(yīng)的相對(duì)不足成了應(yīng)用的的主要障礙之一。家蠶絲腺是一個(gè)高度分化的組織，具有非常強(qiáng)的蛋白合成及分泌能力，因此在生產(chǎn)基因藥物方面絲腺反應(yīng)器有著很好的應(yīng)用前景。
　　 為了實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因家蠶絲腺生物反應(yīng)器實(shí)現(xiàn)hIGF-Ⅰ的分泌表達(dá)，提高重組蛋

2、白表達(dá)水平，簡(jiǎn)化提取工藝，用家蠶絲膠(ser-1)啟動(dòng)子控制絲素重鏈基因fib-H信號(hào)肽和hIGF-Ⅰ融合基因構(gòu)建基于piggyBac轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)基因載體pigA3GFP-serHS-hIGF-Ⅰ-neo，通過(guò)精子介導(dǎo)法導(dǎo)入家蠶，對(duì)篩選獲得轉(zhuǎn)基因家蠶進(jìn)行hIGF-Ⅰ的表達(dá)水平檢測(cè)。通過(guò)piggyBac轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)成功將fib-H信號(hào)肽和hIGF-Ⅰ融合基因表達(dá)盒整合進(jìn)入家蠶基因組，并實(shí)現(xiàn)表達(dá)目的蛋白部分分泌進(jìn)入絲腺腔并最終到達(dá)蠶絲絲膠層。在

3、轉(zhuǎn)基因家蠶G1代每克新鮮中部絲腺組織中hIGF-Ⅰ的表達(dá)水平約為43.8 ng左右，每克蠶繭中hIGF-Ⅰ的含量大約為46.7 ng左右。結(jié)果表明絲素重鏈基因fib-H信號(hào)肽在中部絲腺組織可引導(dǎo)重組蛋白的分泌表達(dá)，提高表達(dá)水平。
　　 此外，用家蠶絲素Fhx/P25啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)hIGF-Ⅰ，構(gòu)建了轉(zhuǎn)基因載體pigA3GFP-Fhx/P25-hIGF-ie-neo，該載體以精子介導(dǎo)法導(dǎo)入蠶卵，通過(guò)篩選并結(jié)合分子生物學(xué)鑒定，獲得了轉(zhuǎn)基

4、因家蠶。通過(guò)綠色熒光觀察結(jié)合采用10 mg/ml的G418篩選，PCR和點(diǎn)雜交鑒定，將IGF-Ⅰ轉(zhuǎn)基因家蠶系多代培養(yǎng)，選取G8代家蠶幼蟲解剖，取其后部絲腺制作凍干粉。ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示G8代hIGF-Ⅰ在每克后部絲腺組織凍干粉中的表達(dá)水平為493 ng左右。通過(guò)尾部靜脈注射鏈脲霉素(STZ)建立糖尿病(DM)小鼠模型，用后部絲腺凍干粉對(duì)其灌胃，結(jié)果 DM小鼠血糖明顯下降(P<0.05)。表明轉(zhuǎn)基因家蠶絲腺表達(dá)hIGF-Ⅰ具有生物學(xué)活