家蠶內(nèi)源性piRNA促進家蠶piggyBac轉(zhuǎn)座子的穩(wěn)定性.pdf

1、轉(zhuǎn)座子作為生物體中能夠獨立移動的特異DNA序列元件，是自然界中最豐富的基因種類之一，轉(zhuǎn)座子的存在與活動使基因組并不是一個靜止的組合，而是一個不斷改變自身構(gòu)造的動態(tài)機體，在進化、個體差異和生物多樣性的保持中發(fā)揮了至關重要的作用。然而，轉(zhuǎn)座子的過度活躍也會引起基因組的紊亂，從而導致過量突變和各類疾病的發(fā)生，因此，機體進化出了一種新的機制—piRNA來平衡基因組的動態(tài)變化。研究轉(zhuǎn)座子與piRNA之間的動態(tài)平衡機制，對解開進化的神秘面紗和遺傳變

2、異的分子基礎，具有重要的意義。家蠶的性別決定為ZW型，具有強雌決定作用的W染色體可以轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生大量的piRNA，是研究轉(zhuǎn)座子與piRNA相互作用的理想研究模型。本研究通過調(diào)查家蠶W和Z染色體上外源piggyBac轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座活性，結(jié)合多層面轉(zhuǎn)錄組學的方法，揭示了轉(zhuǎn)座子活性與piRNA表達量之間的關系，所獲得的的主要結(jié)果和結(jié)論如下:
　　1、Z染色體單拷貝轉(zhuǎn)基因品系的建立
　　在本實驗室前期研究中，已經(jīng)獲得了兩個插入位點位于W染

3、色體的轉(zhuǎn)基因品系，分別命名為TG-W1和TG-W2。為了探究Z染色體上的轉(zhuǎn)基因的穩(wěn)定性是否受到其piRNA的影響，從100多個轉(zhuǎn)基因品系中，篩選獲得了1個插入位點在Z染色體上的轉(zhuǎn)基因品系，命名為TG-Z。將TG-Z轉(zhuǎn)基因家蠶（♀）與野生型家蠶(♂)雜交，F(xiàn)1代個體中雄性家蠶的復眼和神經(jīng)中均能觀察到綠色熒光，雌性家蠶沒有熒光。將獲得TG-Z品系與野生型經(jīng)過5代雜交，后代結(jié)果都是雄性有綠色熒光，雌性無熒光表達。為了確認該品系中綠色熒光轉(zhuǎn)基因

4、載體的插入位點，對該家蠶個體進行了反向PCR，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因載體的插入位點是位于1號染色體上11.5Mb處，遺傳連鎖位置為23.7cM。
　　2、piggyBac轉(zhuǎn)座子在Z和W染色體上的穩(wěn)定性
　　為了檢測piggyBac轉(zhuǎn)座子在轉(zhuǎn)基因家蠶中的再轉(zhuǎn)座活性，我們發(fā)明了利用性染色體連鎖和穩(wěn)定表達外源轉(zhuǎn)座酶的策略。由于W染色體只存在于雌蠶中，因此W連鎖的轉(zhuǎn)基因只在雌性個體中能檢測到轉(zhuǎn)基因標記;Z染色體在雌蠶中只有一條，因此子代的Z

5、連鎖的雌蠶與非轉(zhuǎn)基因雄蠶的子代個體中只有雄性個體中能檢測到轉(zhuǎn)基因標記。將TG-W1、TG-W2和TG-Z的雌性家蠶分別與在家蠶全身表達轉(zhuǎn)座酶的穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因品系TG-R雄性家蠶雜交，得到的后代命名為T-W1\W2＼Z-R;將F1代中同時含有綠色和紅色熒光的個體與野生型家蠶雜交，根據(jù)后代的熒光表達數(shù)目，計算piggyBac的再轉(zhuǎn)座率。結(jié)果顯示，piggyBac在TG-W1品系中的再轉(zhuǎn)座效率為2.77％;在TG-W2中為5.68％;在TG-Z中

6、為16.73％。表明piggyBac在W染色體上的再轉(zhuǎn)座效率要顯著低于Z染色體。
　　3、不同轉(zhuǎn)基因品系中的差異表達基因分析
　　為了探究piggyBac轉(zhuǎn)座子在三個轉(zhuǎn)基因品系間的再轉(zhuǎn)座率差異大的分子機理，我們提取了不同個體的卵巢和大腦組織RNA，進行了轉(zhuǎn)錄組測序分析。提取的樣品濃度均在200ng\μL以上，將提取的組織RNA進行安捷倫檢測，RNA的完整度(RNA Integrity Number)均在6.0以上。對轉(zhuǎn)錄組數(shù)

7、據(jù)進行基因差異表達分析(DEGs)、GO功能顯著性富集分析、Pathway顯著性富集分析三方面的數(shù)據(jù)分析，不同的轉(zhuǎn)基因個體間基因差異表達比較大，GO注釋分成了三類:基因的分子功能(molecular function)、細胞成分(cellular component)、參與的生物過程(biologicalprocess)，在不同的功能層面均有不同的基因注釋。Pathway主要將差異基因富集到細胞過程、環(huán)境信息加工、遺傳信息加工、新陳代謝

8、以及生物體系統(tǒng)通路。雖然我們鑒定到了較多的差異表達基因，但是對這些基因的深入分析并沒有發(fā)現(xiàn)其與轉(zhuǎn)座子活性有直接的關系，我們推測這些差異可能是由于不同轉(zhuǎn)基因的插入位點不一樣而引起的變化。
　　4、不同轉(zhuǎn)基因品系small RNA的鑒定與分析
　　從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的分析結(jié)果，推測piggyBac在不同染色體轉(zhuǎn)座效率的不同不是由特定基因的表達差異引起的，加之越來越多的線索表明轉(zhuǎn)座子的活性可能與piRNA的表達有較大的關系，因此，對不同

9、轉(zhuǎn)基因品系的卵巢和腦組織進行了小RNA測序和分析。對miRNA也是做了與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)同樣的三個方面的分析，沒有發(fā)現(xiàn)顯著的差異，暗示miRNA與轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座活性也沒有直接的相關性;通過借助文獻中對piRNA分析的方法，發(fā)現(xiàn)大腦中的差異轉(zhuǎn)座子表達量明顯低于卵巢轉(zhuǎn)座子差異表達，而且卵巢中的piRNA表達量大約有76％，大腦中的piRNA表達量大約有24％。將piRNA與轉(zhuǎn)基因載體及其插入位點上下游序列比對，結(jié)果表明TG-W1\W2\Z卵巢比對上

10、的piRNA數(shù)量大于大腦中比對上的數(shù)量，同時也發(fā)現(xiàn)卵巢中轉(zhuǎn)基因插入位點的兩側(cè)具有高量的piRNA富集，其中TG-Z插入位點附近中piRNA的數(shù)量顯著低于TG-W1\W2中piRNA的數(shù)量。這一結(jié)果暗示，piggyBac轉(zhuǎn)座子在W和Z染色體上再轉(zhuǎn)座效率的差異可能是由于插入位點附近piRNA含量的差異導致的。
　　綜上所述，本論文通過轉(zhuǎn)基因、遺傳學分析、轉(zhuǎn)錄組分析和小RNA測序，首次揭示了piggyBac這一廣泛應用于動植物轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)