卵巢癌鉑類(lèi)耐藥標(biāo)記蛋白Annexin A3化學(xué)發(fā)光試劑盒的研制及其在臨床應(yīng)用中的研究.pdf

1、研究背景及目的：
　　 卵巢癌是死亡率居首位的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性是臨床治療的主要障礙。運(yùn)用鉑類(lèi)耐藥標(biāo)記蛋白，早期發(fā)現(xiàn)腫瘤耐藥，有助于臨床及時(shí)調(diào)整化療方案，改善患者預(yù)后。
　　 本課題組前期運(yùn)用比較蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，發(fā)現(xiàn)并證實(shí)了一種卵巢癌鉑類(lèi)耐藥標(biāo)記蛋白膜聯(lián)蛋白A3(AnnexinA3)，該蛋白能夠以細(xì)胞內(nèi)囊泡形成、轉(zhuǎn)運(yùn)、外泌體的形式外泌，在細(xì)胞培養(yǎng)液上清和人外周血中均可檢測(cè)到不同水平的表達(dá)，

2、AnnexinA3有望成為一種鉑類(lèi)耐藥血清學(xué)標(biāo)記物應(yīng)用于臨床。然而，在擴(kuò)大樣本量進(jìn)行l(wèi)臨床檢測(cè)的研究中發(fā)現(xiàn)，本課題組所應(yīng)用的目前市場(chǎng)上唯一可提供的ELISA試劑盒存在敏感度低、重復(fù)性差等突出問(wèn)題，造成實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性欠佳。因此，研制一種能高通量、穩(wěn)定檢測(cè)人外周血AnnexinA3蛋白表達(dá)水平的免疫分析試劑盒成為本課題深入研究中亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題。
　　 化學(xué)發(fā)光免疫分析法(CLIA)是繼放射免疫分析法、酶免疫分析法和熒光免疫分析

3、法之后發(fā)展起來(lái)的一種新的免疫學(xué)測(cè)定方法，該技術(shù)將高特異性的抗原抗體反應(yīng)與高靈敏度的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)結(jié)合起來(lái)，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)便、分析快速、無(wú)放射污染等優(yōu)點(diǎn)，成為目前臨床檢測(cè)蛋白分子的主流方法。
　　 本實(shí)驗(yàn)在前期有關(guān)卵巢癌鉑類(lèi)耐藥特異性標(biāo)記蛋白AnnexinA3工作的基礎(chǔ)上進(jìn)行深入研究，旨在制備能夠滿(mǎn)足臨床檢測(cè)要求的AnnexinA3蛋白化學(xué)發(fā)光試劑盒，并應(yīng)用該試劑盒對(duì)不同女性人群外周血中的AnnexinA3

4、蛋白進(jìn)行檢測(cè)，以了解該蛋白在人外周血中的表達(dá)情況，初步確定其正常值范圍，并探討其作為血清學(xué)標(biāo)志物對(duì)臨床上卵巢癌患者鉑類(lèi)化療耐藥的預(yù)測(cè)價(jià)值。
　　 研究方法：
　　 1、篩選匹配高特異性的AnnexinA3抗原及抗體對(duì)，制備檢測(cè)人外周血中AnnexinA3蛋白的化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒。
　　 購(gòu)買(mǎi)市售的人AnnexinA3重組蛋白及六種AnnexinA3多克隆、單克隆抗體作為檢測(cè)抗原和抗體，化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測(cè)不

5、同組合的兩種抗體與各濃度抗原反應(yīng)的發(fā)光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算線(xiàn)性擬合相關(guān)系數(shù)r及信噪比(最高濃度標(biāo)準(zhǔn)品與0值標(biāo)準(zhǔn)品發(fā)光值之比，S5/SO)，r值越接近1、信噪比越大表明抗原抗體間的結(jié)合特異性越高，選擇r值及信噪比最大的兩種抗體作為制備試劑盒的捕獲抗體和檢測(cè)抗體。將人AnnexinA3重組蛋白稀釋成不同濃度作為標(biāo)準(zhǔn)品，將篩選出的捕獲抗體包被在固相載體上，采用改良過(guò)碘酸鈉法連接檢測(cè)抗體和辣根過(guò)氧化物酶制備出酶標(biāo)槍測(cè)抗體，兩種抗體與抗原形成雙

6、抗體夾心復(fù)合物，加入發(fā)光底物后,使該復(fù)合物發(fā)光，化學(xué)發(fā)光儀檢測(cè)發(fā)光強(qiáng)度。交叉方陣滴定法確定捕獲抗體與酶標(biāo)檢測(cè)抗體的最佳工作濃度，并分別采用一步法和兩步法對(duì)反應(yīng)模式進(jìn)行優(yōu)化，最終確立最佳檢測(cè)體系，完成試劑盒的制備。
　　 2、對(duì)制備完成的AnnexinA3化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行靈敏度、精密度和稀釋線(xiàn)性的評(píng)價(jià)，確定檢測(cè)工作范圍，并與本課題組前期研究中應(yīng)用的目前市場(chǎng)上唯一可提供的AnnexinA3酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)試劑盒進(jìn)行

7、比較評(píng)價(jià)。
　　 平行測(cè)量20個(gè)零值標(biāo)準(zhǔn)品(SO)，以其發(fā)光值(RLU)的平均值(Mean)加上兩倍標(biāo)準(zhǔn)差(SD)所對(duì)應(yīng)的濃度值求得本方法的靈敏度。精密度指測(cè)定結(jié)果的可重復(fù)性，評(píng)價(jià)指標(biāo)為變異系數(shù)(coefficientofvariation，CV)，分別用1.6ng/mL和0.8ng/mL兩種濃度的AnnexinA3蛋白作為高、低值質(zhì)控品，每個(gè)質(zhì)控品平行做20孔，用不同批次的包被板重復(fù)測(cè)3次，計(jì)算單次檢測(cè)(批內(nèi))和多次檢測(cè)(批間

8、)的CV值，CV(％)=標(biāo)準(zhǔn)差(SD)/均數(shù)(Mean)。將1份本課題組前期實(shí)驗(yàn)中用ELISA法測(cè)定為高值的血清樣品(濃度為1.25ng/mL)，按1:1、1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64進(jìn)行倍比稀釋后測(cè)定發(fā)光值，對(duì)稀釋倍數(shù)及發(fā)光值進(jìn)行線(xiàn)性擬合，計(jì)算相關(guān)系數(shù)r。將各濃度的標(biāo)準(zhǔn)品重復(fù)檢測(cè)10次，根據(jù)每次的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)求得相應(yīng)濃度值，計(jì)算10次測(cè)量的均數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)差，進(jìn)而求出各濃度點(diǎn)的變異系數(shù)CV，以CV為縱坐標(biāo)，濃度值為橫坐標(biāo)

9、，繪制精密度曲線(xiàn)圖，選用圖中變異系數(shù)小于10％的濃度范圍作為試劑盒的工作范圍。取健康女性、卵巢良性腫瘤、上皮性卵巢癌患者的血清樣本各20份，分別應(yīng)用兩種試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，比較測(cè)定值的分布及對(duì)低值血樣的區(qū)分情況。
　　 3、應(yīng)用AnnexinA3化學(xué)發(fā)光試劑盒高通量檢測(cè)人外周血中AnnexinA3蛋白的表達(dá)水平，確定其正常值范圍，評(píng)估其作為卵巢癌鉑類(lèi)化療耐藥血清學(xué)標(biāo)志物的可行性，同時(shí)與CA125比較在臨床診斷卵巢癌耐藥中的作用。

10、r>　　 連續(xù)收集2009年9月至2012年4月期間在北京協(xié)和醫(yī)院體檢的健康女性血清、以及住院手術(shù)治療的卵巢良性和交界性腫瘤患者術(shù)前血清、上皮性卵巢癌患者治療前血清，應(yīng)用CLIA試劑盒檢測(cè)AnnexinA3蛋白在各組人群外周血中的濃度，初步建立其正常參考值范圍。前瞻性連續(xù)收集卵巢癌患者治療前、術(shù)后化療前、化療過(guò)程中以及化療結(jié)束后的血清樣本，并記錄同期的CA125測(cè)定值。應(yīng)用CLIA試劑盒檢測(cè)AnnexinA3的濃度，評(píng)估各臨床病理因素

11、、手術(shù)及化療對(duì)AnnexinA3表達(dá)水平的影響。對(duì)所有卵巢癌患者進(jìn)行隨訪(fǎng)，根據(jù)目前對(duì)卵巢癌鉑類(lèi)耐藥的定義判斷患者的化療結(jié)局，分為敏感組和耐藥組，明確AnnexinA3在兩組患者不同治療時(shí)點(diǎn)的動(dòng)態(tài)變化及表達(dá)差異。與CA125進(jìn)行相關(guān)性分析，探討各治療時(shí)點(diǎn)的AnnexinA3表達(dá)水平與鉑類(lèi)耐藥的關(guān)系，通過(guò)診斷試驗(yàn)評(píng)估CA125及AnnexinA3對(duì)鉑類(lèi)耐藥的診斷或預(yù)測(cè)作用：制作受試者工作特征(ROC)曲線(xiàn)，計(jì)算曲線(xiàn)下面積(AUC)以及各濃度

12、值對(duì)應(yīng)的約登指數(shù)(又稱(chēng)正確診斷指數(shù)，等于敏感度與特異度之和減1)，AUC=0.5表明無(wú)診斷價(jià)值，AUC在0.5～0.7時(shí)有較低準(zhǔn)確性，在0.7～0.9時(shí)有一定準(zhǔn)確性，在0.9以上有較高準(zhǔn)確性，約登指數(shù)最大時(shí)表明以該對(duì)應(yīng)濃度為界值進(jìn)行診斷的準(zhǔn)確性最高，因此選擇該濃度值為最佳診斷界值，計(jì)算此時(shí)診斷的敏感度、特異度、準(zhǔn)確度(總符合率)、假陽(yáng)性率、假陰性率、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值及陰性預(yù)測(cè)值。通過(guò)COX風(fēng)險(xiǎn)回歸模型及Kaplan-Meier生存分析評(píng)估治療

13、前AnnexinA3水平對(duì)患者無(wú)進(jìn)展生存期的影響。
　　 研究結(jié)果：
　　 1、選用兔抗-AnnexinA3多克隆抗作為捕獲抗體，鼠抗-AnnexinA3多克隆抗體作為檢測(cè)抗體時(shí)，與各濃度AnnexinA3抗原反應(yīng)得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的相關(guān)系數(shù)r及信噪比均最大，分別為0.9982和19.56，故選擇兩者應(yīng)用于試劑盒的制備。采用濃度為5μg/mL的捕獲抗體包被固相載體，稀釋度為1:250的酶標(biāo)檢測(cè)抗體進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，與各濃度Anne

14、xinA3標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的相關(guān)系數(shù)r及信噪比均最大，分別為0.9987和59.33，從而確定為最佳工作濃度。采用一步法和兩步法檢測(cè)時(shí)的相關(guān)系數(shù)均較好，分別為0.9983和0.9986，但一步法的信噪比略高于兩步法(49.llvs45.57)，結(jié)合操作的簡(jiǎn)便性，反應(yīng)模式選擇一步法。
　　 2、試劑盒的最低檢測(cè)濃度即靈敏度為0.08ng/mL;批內(nèi)精密度為5.92～8.63％，批間精密度為5.15～6.42％;高值血樣的稀

15、釋度與發(fā)光值間呈良好的線(xiàn)性相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r為0.9997;標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)在0.1～1.6ng/mL濃度之間的變異系數(shù)均小于10％，因此選定0.1～1.6ng/mL作為工作范圍。兩種試劑盒檢測(cè)結(jié)果顯示，ELISA試劑盒對(duì)60份血樣的中位測(cè)值為0.36ng/mL(0.1～2.03ng/mL)，其中80％(48/60)的血樣測(cè)值低于標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)建議的最低濃度(0.8ng/mL),30％(18/60)低于ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)標(biāo)明的最低檢測(cè)濃度(0.2n

16、g/mL);CLIA試劑盒對(duì)60份血樣的中位測(cè)值為0.95ng/mL(0.04～2.77ng/mL)，90％(54/60)的血樣測(cè)值位于標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)范圍內(nèi)，其中2例低于試劑盒最低檢測(cè)濃度(0.08ng/mL),4例高于標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上限(1.6ng/mL)，將該4份高值血清分別稀釋2倍、4倍、8倍后進(jìn)行復(fù)測(cè)，不同稀釋倍數(shù)得到的最終測(cè)值間具有較好的一致性，變異系數(shù)均不到3％。CLIA試劑盒的操作步驟也較ELISA試劑盒簡(jiǎn)單，前者采用樣本和酶標(biāo)檢測(cè)抗

17、體同時(shí)加入的一步法檢測(cè)模式，反應(yīng)時(shí)間僅需2小時(shí)，而后者則需將樣本和酶標(biāo)檢測(cè)抗體分三步加入，反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)達(dá)4.5小時(shí)。
　　 3、共納入符合標(biāo)準(zhǔn)的健康女性113例，卵巢良性腫瘤患者70例，卵巢交界性腫瘤患者14例，上皮性卵巢癌患者96例。四組人群外周血AnnexinA3的中位濃度分別為0.75ng/mL(0.15～1.54ng/mL)、0.66ng/mL(0.04～1.79ng/mL)、0.65ng/mL(0.14～3.29ng/m

18、L)以及1.12ng/mL(0.20～6.18ng/mL);卵巢癌患者治療前AnnexinA3水平明顯高于健康女性及卵巢良性腫瘤患者(P值均為0.000)，健康女性與卵巢良性腫瘤患者相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.322)，卵巢交界性腫瘤患者與其余三組人群相比均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P值分別為0.144、0.132、0.236)。AnnexinA3在113例健康女性外周血中的表達(dá)水平呈近似正態(tài)分布(Z=0.723，P=0.673＞0.05)，采用正態(tài)

19、分布法確定參考值范圍，正常值上限為Mean+1.96SD=1.45ng/mL。
　　 卵巢癌患者治療前AnnexinA3水平與年齡、組織學(xué)類(lèi)型、組織學(xué)分級(jí)、手術(shù)病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無(wú)關(guān)(P值分別為0.985、0.631、0.347、0.441、0.480)；術(shù)前及術(shù)后化療前AnnexinA3的中位濃度分別為1.11ng/mL(0.43～4.55ng/mL)、1.23ng/mL(0.4～4.32ng/mL)，相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P

20、=0.226)；化療前、化療中、化療后AnnexinA3的中位濃度分別為1.15ng/mL(0.42～6.18ng/mL)、0.23ng/mL(0.02～3.OOng/mL)以及0.24ng/mL(0.03～1.82ng/mL)，化療中和化療后較化療前明顯降低(P值均為0.000)，化療中與化療后相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.487)。
　　 截至2012年4月30日隨訪(fǎng)結(jié)束，96例卵巢癌患者的中位隨訪(fǎng)時(shí)間為10.73個(gè)月(2.23

21、～32.17個(gè)月)，共有56例可明確判斷鉑類(lèi)耐藥性結(jié)局，其中鉑類(lèi)敏感患者41例(占73.21％)，耐藥患者15例(占26.79％)；共有2l例患者出現(xiàn)疾病進(jìn)展,3例失訪(fǎng),3例仍在進(jìn)行先期化療，尚未手術(shù)。
　　 敏感組患者治療前、化療中、化療后的AnnexinA3中位濃度分別0.80ng/mL(0.20～2.43ng/mL)、0.3lng/mL(0.02～0.84ng/mL)、0.22ng/mL(0.06～0.75ng/mL),耐

22、藥組患者分別為2.21ng/mL(0.5～6.18ng/mL)、0.16ng/mL(0.04～0.76ng/mL)、0.24ng/mL(0.03～1.79ng/mL)，兩組患者化療中及化療后的AnnexinA3水平均較化療前明顯降低(P值均為0.000)，化療中與化療后相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P值分別為0.605、0.296);組間比較顯示，耐藥組患者治療前AnnexinA3水平明顯高于敏感組(P=0.012)，而化療中與化療后兩組的Anne

23、xinA3水平無(wú)明顯差別(P值分別為0.937、0.624)。
　　 敏感及耐藥患者治療前CA125的平均濃度分別為(1096.51±1689.91)U/mL、(1896.48±2162.88)U/mL，兩組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.271)，而耐藥組患者化療中CA125的表達(dá)水平明顯高于敏感組(P=0.003)，平均濃度分別為(16.52±12.47)U/mL、(198.89±527.32)U/mL，經(jīng)相關(guān)性分析，治療前、化療

24、中及化療后AnnexinA3的表達(dá)水平均與CA125無(wú)關(guān)(P值分別為0.384、0.594、0.883)。治療前CA125對(duì)鉑類(lèi)耐藥無(wú)診斷作用，ROC曲線(xiàn)下面積AUC為0.597(P=0.271);化療中CA125診斷鉑類(lèi)耐藥的AUC為0.755(P=0.014)，最佳界值點(diǎn)為24.60U/mL，此時(shí)診斷鉑類(lèi)耐藥的敏感度為60.00％，特異度為90.24％，準(zhǔn)確度為82.14％，假陽(yáng)性率為40.00％，假陰性率為9.76％，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為

25、69.23％，陰性預(yù)測(cè)值為86.01％。
　　 以正常參考值上限1.45ng/mL為界對(duì)治療前患者進(jìn)行分組，高水平組發(fā)生鉑類(lèi)耐藥的比率明顯高于低水平組(55.56％vs13.16％，P=0.001)，Logistic回歸分析顯示，治療前AnnexinA3水平是發(fā)生鉑類(lèi)耐藥的危險(xiǎn)因素之一(P=0.004，OR=9.241)，高水平組發(fā)生鉑類(lèi)耐藥的風(fēng)險(xiǎn)是低水平組的9.241倍。診斷試驗(yàn)結(jié)果顯示，治療前AnnexinA3診斷鉑類(lèi)耐藥的

26、AUC為0.744(P=0.006)，最佳界值點(diǎn)為1.645ng/mL，此時(shí)治療前AnnexinA3預(yù)測(cè)鉑類(lèi)耐藥的敏感度為66.70％，特異度為82.93％，準(zhǔn)確度為78.57％，假陽(yáng)性率為17.07％，假陰性率為33.30％，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為58.82％，陰性預(yù)測(cè)值為87.18％。COX風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析顯示，治療前AnnexinA3水平是影響患者疾病進(jìn)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P=0.001，RR=9.863)，高水平組發(fā)生疾病進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)是低水平

27、組的9.863倍，Kaplan-Meier生存分析顯示，兩組的中位PFS分別為27.60個(gè)月(2.23～32.17個(gè)月)和12.77個(gè)月(4.90～25.80個(gè)月)，高水平組的PFS顯著短于低水平組(P=0.001)。
　　 結(jié)論：
　　 1、本研究從市售的六種AnnexinA3多克隆、單克隆抗體中篩選出與人AnnexinA3重組蛋白特異性結(jié)合最好的兩種作為制備化學(xué)發(fā)光試劑盒的捕獲抗體和檢測(cè)抗體，首次成功制備出人Anne

28、xinA3蛋白化學(xué)發(fā)光定量檢測(cè)試劑盒。
　　 2、本研究制備的AnnexinA3化學(xué)發(fā)光試劑盒具有較高的靈敏度，良好的重復(fù)性和稀釋線(xiàn)性，操作方便、分析迅速，明顯優(yōu)于市售ELISA試劑盒，能夠滿(mǎn)足臨床檢測(cè)的要求，但該試劑盒還存在檢測(cè)上限值偏低、高值血清樣本需重新稀釋后復(fù)測(cè)的缺點(diǎn)，需進(jìn)一步改善以增加檢測(cè)的線(xiàn)性范圍。
　　 3、應(yīng)用本研究研制的化學(xué)發(fā)光試劑盒可以檢測(cè)到不同人群外周血中AnnexinA3蛋白的差異表達(dá)，卵巢癌患者

29、治療前AnnexinA3水平明顯高于健康女性及卵巢良性腫瘤患者，初步確定女性外周血AnnexinA3的正常參考值上限。前瞻性觀(guān)察56例可隨診結(jié)局的卵巢上皮癌患者，治療前耐藥組AnnexinA3的的測(cè)定值明顯高于敏感組，化療期間耐藥組CA125的的測(cè)定值明顯高于敏感組，提示卵巢癌患者治療前外周血AnnexinA3的測(cè)定值對(duì)于臨床出現(xiàn)鉑類(lèi)耐藥具有一定的預(yù)測(cè)作用,化療期間CA125測(cè)定值對(duì)于臨床出現(xiàn)鉑類(lèi)耐藥具有一定的診斷作用。此外，治療前An