GRP78在卵巢癌順鉑耐藥中的作用及其調控機制的體外研究.pdf

1、目的:
　　 本研究旨在探討GRP78在卵巢癌順鉑耐藥中的作用及其作用機制，為探索有效逆轉卵巢癌順鉑耐藥提供新靶點與新思路。
　　 方法:
　　 本研究應用RT-PCR法及Western免疫印跡法檢測卵巢癌細胞株SKOV3和SKOV3/DDP細胞中GRP78及其蛋白表達水平;以GRP78調節(jié)因子BAPTA-AM、A23187分別下調、上調卵巢癌細胞中GRP78表達，以RT-PCR法及Western免疫印跡法檢測卵

2、巢癌SKOV3和SKOV3/DDP細胞中GRP78、PI3K、AKT、p-AKTmRNA及其蛋白表達水平改變;以MTT法檢測順鉑對SKOV3及SKOV3/DDP細胞生長抑制率，并確定BAPTA-AM、A23187對卵巢癌順鉑化療敏感性的影響;采用流式細胞技術分析GRP78調節(jié)因子在順鉑對卵巢癌SKOV3和SKOV3/DDP細胞凋亡水平及其周期分布特點的影響，從而確定GRP78在卵巢癌細胞順鉑耐藥中的作用及其作用機制。
　　 結果

3、:
　　 1.卵巢癌細胞中GRP78表達及其與順鉑敏感性的關系:GRP78在SKOV3細胞及SKOV3/DDP細胞中均有表達，但SKOV3/DDP細胞中GRP78 mRNA及其蛋白表達水平均高于SKOV3細胞。其中GRP78 mRNA相對表達強度分別為:SKOV3細胞(0.5464±0.04048)、SKOV3/DDP細胞(0.7267±0.05508)，兩組細胞比較差異有統(tǒng)計學意義(t=0.01，P＜0.05)。GRP78蛋白

4、相對表達強度分別為:SKOV3細胞(0.4937±0.03147)、SKOV3/DDP細胞(0.6913±0.05633)，兩組細胞比較差異有統(tǒng)計學意義(t=5.304，P=0.006＜0.05)?？梢奊RP78表達增高與卵巢癌順鉑耐藥有關。
　　 2.調節(jié)卵巢癌細胞GRP78表達對腫瘤細胞順鉑敏感性的影響:以BAPTA-AM處理SKOV3和SKOV3/DDP細胞，腫瘤細胞GRP78 mRNA及其蛋白表達水平均下降，相對表達強度

5、分別為SKOV3細胞(0.3200±0.01000)、(0.3100±0.02000)，SKOV3/DDP細胞為(0.4400±0.03464)、(0.3500±0.04000)，對照組GRP78mRNA及蛋白表達水平分別為SKOV3細胞（0.5133±0.03512）、（0.5033±0.03215）;SKOV3/DDP細胞為(0.6300±0.04359)、(0.6467±0.07506)，兩組相比差異有統(tǒng)計學意義(SKOV3細胞t

6、=8.286, P=0.014;t=6.526, P=0.023; SKOV3/DDP細胞t=9.127, P=0.012;t=5.130, P=0.036)。
　　 經(jīng)A23187處理SKOV3和SKOV3/DDP細胞，GRP78 mRNA及其蛋白表達水平均增加，分別為SKOV3細胞(0.76004±0.07211)、(0.7233±0.03512),SKOV3/DDP細胞(0.8733±0.03786)、(0.8500±0.

7、02646)，與對照組GRP78 mRNA及蛋白表達水平[SKOV3細胞（0.5133±0.03512）、(0.5033±0.03215); SKOV3/DDP細胞為(0.6300±0.04359)、(0.6467±0.07506)]相比差異有統(tǒng)計學意義(t=5.615,P=0.030；t=4.778, P=0.041)。
　　 SKOV3細胞和SKOV3/DDP細胞經(jīng)BAPTA-AM藥物作用后GRP78表達水平下降，而腫瘤細胞

8、對DDP敏感性分別增加了37.15％、52.91％。但是經(jīng)A23187藥物作用后，腫瘤細胞GRP78表達水平增加，其對DDP敏感性分別降低了54.86％、27.72％。推測GRP78表達水平增高與卵巢癌順鉑耐藥性有關，下調GRP78表達能夠增強卵巢癌順鉑敏感性。
　　 3.調節(jié)GRP78對SKOV3、SKOV3/DDP細胞PI3K、AKT、p-AKT表達的影響
　　 (1)經(jīng)BAPTA-AM下調GRP78表達后，腫瘤細胞

9、中PI3K、AKTmRNA相對表達水平分別下降為SKOV3細胞(0.2600±0.03606)、(0.3867±0.04041);SKOV3/DDP細胞(0.3767±0.03055)、(0.4500±0.0100)，對照組PI3K、AKTmRNA相對表達水平分別為SKOV3細胞(0.4367±0.03215)、(0.6167±0.03512);SKOV3/DDP細胞(0.5600±0.04359)、(0.7067±0.01528)，經(jīng)

10、統(tǒng)計學分析，差異有統(tǒng)計學意義(SKOV3細胞t=8.082,P=0.015;t=23.000, P=0.002;SKOV3/DDP細胞t=12.618, P=0.006; t=17.665, P=0.003)。
　　 經(jīng)BAPTA-AM下調GRP78表達后，兩種細胞中PI3K、AKT、p-AKT蛋白相對表達水平分別下降為SKOV3細胞(0.4033±0.04163)、（0.3611±0.03464）、(0.3600±0.0435

11、9);SKOV3/DDP細胞(0.4933±0.02517)、(0.5000±0.04163)、（0.4267±0.04041），對照組PI3K、AKT、p-AKT蛋白相對表達水平分別為SKOV3細胞（0.5267±0.04726）、（0.5433±0.04619）、(0.4600±0.0100); SKOV3/DDP細胞(0.6500±0.03606)、(0.6800±0.02646)、(0.5767±0.03215)，經(jīng)統(tǒng)計學分析，

12、差異有統(tǒng)計學意義(SKOV3細胞t=10.262, P=0.009;t=27.5, P=0.001; t=5.000,P=0.038);SKOV3/DDP細胞(t=17.764, P=0.003;t=4.750, P=0.042;t=12.990,P=0.006)。
　　 (2)經(jīng)A23187上調GRP78后，腫瘤細胞中PI3K、AKTmRNA表達水平分別升高，它們相對表達量為SKOV3細胞(0.6867±0.02082)、(0

13、.7200±0.01732);SKOV3/DDP細胞(0.7467±0.04041)、(0.8467±0.03055)，對照組PI3K、AKTmRNA相對表達水平分別為SKOV3細胞(0.4367±0.03215)、(0.6167±0.03512);SKOV3/DDP細胞(0.5600±0.04359)、(0.7067±0.01528)，經(jīng)統(tǒng)計學分析，差異有統(tǒng)計學意義(SKOV3細胞t=7.529，P=0.017;t=7.750，P=0

14、.016;SKOV3/DDP細胞t=5.518,P=0.031;t=9.165,P=0.012)。
　　 經(jīng)A23187上調GRP78后，兩種細胞中PI3K、AKT、p-AKT蛋白表達水平也都升高，其相對表達量為SKOV3細胞(0.6633±0.07506)、（0.6567±0.03512）、（0.5367±0.03055）;SKOV3/DDP細胞(0.7200±0.03000)、（0.8300±0.04000）、(0.6900

15、±0.02000)，對照組PI3K、AKT、p-AKT蛋白相對表達水平分別為SKOV3細胞（0.5267±0.04726）、（0.5433±0.04619）、(0.4600±0.0100); SKOV3/DDP細胞(0.6500±0.03606)、（0.6800±0.02646）、(0.5767±0.03215)，經(jīng)統(tǒng)計學分析，差異有統(tǒng)計學意義（SKOV3細胞t=4.799，P=0.041;t=9.430，P=0.011;t=4.6，P

16、=0.044;SKOV3/DDP細胞t=4.583,P=0.044;t=15,P=0.004;t=9.430,P=0.011）?？梢奊RP78可調節(jié)PI3K、AKT、p-AKT的表達。推測GRP78可能通過PI3K/AKT信號轉導通路參與卵巢癌順鉑耐藥。
　　 4.調節(jié)GRP78對SKOV3、SKOV3/DDP細胞凋亡及細胞周期的影響:經(jīng)BAPTA-AM下調GRP78表達后，SKOV3及SKOV3/DDP細胞的凋亡率(27.42

17、％，21.91％)較對照組(19.57％，12.74％)增加;經(jīng)A23187上調GRP78表達后，SKOV3及SKOV3/DDP兩種細胞的凋亡率(12.21％，7.22％)較對照組(19.57％，12.74％)降低，且敏感株SKOV3細胞凋亡率比SKOV3/DDP細胞凋亡率高。
　　 在兩種細胞中，隨著GRP78表達的降低，G1期細胞比率逐漸增高，S期及G2期細胞比率則逐漸減少，推測GRP78表達降低可導致細胞SKOV3及SKO