卵巢癌鉑類耐藥標(biāo)記蛋白Annexin A3對臨床化療耐藥預(yù)測作用的前瞻性研究.pdf

1、研究背景及目的：
　　 卵巢上皮癌是女性生殖器官中死亡率居第一位的惡性腫瘤，目前的標(biāo)準(zhǔn)治療方案是在腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)的基礎(chǔ)上輔以紫杉醇和鉑類聯(lián)合的一線化療，但是預(yù)后不理想，晚期患者的5年生存率仍然徘徊在30％左右。腫瘤細(xì)胞對于化療藥物產(chǎn)生耐藥性是造成卵巢癌的5年生存率得不到進(jìn)一步改善的主要原因之一，初治患者的完全緩解率接近75％，仍有15-30％的患者對初治方案反應(yīng)不佳;在達(dá)到完全緩解的患者中，有＞90％的患者腫瘤復(fù)發(fā)。如何早期發(fā)現(xiàn)

2、和診斷化療耐藥，進(jìn)一步改善卵巢癌的預(yù)后是當(dāng)前困擾婦科腫瘤臨床的主要問題之一。卵巢癌患者對鉑類藥物耐藥的臨床評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)要到化療進(jìn)行到一定階段，或腫瘤復(fù)發(fā)后，才能判斷出患者對于化療藥物的敏感性，因此發(fā)現(xiàn)一種鉑類耐藥標(biāo)記蛋白在患者接受化療之前或治療初期預(yù)知腫瘤的耐藥性，及時(shí)調(diào)整化療方案是解決這一問題的關(guān)鍵途徑。
　　 本課題組前期運(yùn)用比較蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選出了鉑類耐藥相關(guān)蛋白—膜聯(lián)蛋白A3(Annexin A3，ANXA3)，并在體外細(xì)

3、胞實(shí)驗(yàn)、動物實(shí)驗(yàn)及臨床研究中逐步驗(yàn)證了該指標(biāo)和鉑耐藥的相關(guān)性、影響鉑耐藥的機(jī)制、血清可檢測性以及在臨床中作為鉑耐藥預(yù)測指標(biāo)的可行性。因?yàn)槭惺跘nnexin A3 ELISA試劑盒敏感性欠佳、重復(fù)性差，本課題組研制了具有較高靈敏性、可重復(fù)性的Annexin A3化學(xué)發(fā)光定量檢測試劑盒，并在小樣本的前瞻性臨床研究中觀察了該方法檢測的治療前Annexin A3血清濃度對鉑類化療耐藥的診斷價(jià)值，發(fā)現(xiàn)該指標(biāo)具有中等預(yù)測價(jià)值，ROC曲線下面積為0.

4、744，最佳界值點(diǎn)為1.645，該界值的預(yù)測敏感度及特異度分別為66.70％、82.93％，陽性及陰性預(yù)測值分別為58.82％、87.18％。
　　 本研究在現(xiàn)有研究的基礎(chǔ)上前瞻性連續(xù)收集臨床初治的卵巢癌患者的血清學(xué)和組織學(xué)標(biāo)本，以化學(xué)發(fā)光免疫分析和免疫組化技術(shù)分別檢測AnnexinA3蛋白在觀察對象外周血和腫瘤組織中的表達(dá)水平，評估Annexin A3蛋白在患者外周血和腫瘤組織中的表達(dá)水平對臨床化療耐藥的預(yù)測作用及多指標(biāo)聯(lián)合檢

5、測提高預(yù)測價(jià)值的可行性，并對Annexin A3蛋白血清表達(dá)在復(fù)發(fā)上皮性卵巢癌患者中的臨床意義進(jìn)行了初步探討。
　　 研究方法：
　　 1、進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，在較大樣本患者中分析Annexin A3的血清濃度和鉑類化療耐藥的關(guān)系;通過繪制ROC曲線評價(jià)其診斷價(jià)值，確定最佳界值點(diǎn);并將擴(kuò)大樣本前后Annexin A3的血清濃度對鉑類耐藥的診斷價(jià)值進(jìn)行比較。觀察Annexin A3血清濃度對初治患者無進(jìn)展生存的影響。

6、　　 連續(xù)性收集初治上皮性卵巢癌患者治療前血清標(biāo)本及病例資料;采用AnnexinA3化學(xué)發(fā)光定量檢測試劑盒測定收集標(biāo)本的Annexin A3蛋白血清濃度并對其分布進(jìn)行分析;通過查病例或電話回訪隨訪患者的鉑化療結(jié)局;對Annexin A3蛋白血清濃度和臨床病理特征進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析;觀察鉑類敏感及耐藥組間AnnexinA3血清濃度的表達(dá)差別并通過Logistic多因素模型分析AnnexinA3蛋白血清濃度和鉑耐藥的相關(guān)性;繪

7、制ROC曲線評價(jià)AnnexinA3蛋白血清濃度預(yù)測鉑類耐藥的價(jià)值，確定最佳界值點(diǎn)，觀察該界值點(diǎn)的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值及陰性預(yù)測值，并對擴(kuò)大樣本前后Annexin A3蛋白血清濃度對鉑類耐藥的預(yù)測價(jià)值進(jìn)行比較;在Cox多因素模型中分析Annexin A3血清水平對PFS的影響，并通過Log rank檢驗(yàn)比較以最佳界值確定的Annexin A3高濃度組及低濃度組間PFS生存曲線的差別。
　　 2、通過免疫組化技術(shù)檢測Annex

8、in A3蛋白在同一研究人群中的組織表達(dá);分析Annexin A3蛋白的組織表達(dá)和鉑類耐藥的相關(guān)性;通過制作ROC曲線評價(jià)AnnexinA3蛋白對鉑類耐藥的預(yù)測價(jià)值;觀察Annexin A3組織表達(dá)對PFS的影響;在同一研究人群中將Annexin A3蛋白的組織表達(dá)和血清濃度對鉑類耐藥的預(yù)測價(jià)值進(jìn)行比較。
　　 采用免疫組化方法對同一研究人群中腫瘤組織的AnnexinA3蛋白表達(dá)進(jìn)行半定量檢測;將“陰性”及“+”表達(dá)患者定義為低

9、表達(dá)組，將“++”及“+++”表達(dá)患者定義為高表達(dá)組，觀察鉑類敏感及耐藥人群中Annexin A3蛋白的組織表達(dá)差異并通過多因素分析觀察Annexin A3組織表達(dá)與鉑化療耐藥的相關(guān)性;繪制ROC曲線計(jì)算曲線下面積評價(jià)Annexin A3組織表達(dá)對鉑耐藥的診斷價(jià)值，確定最佳界值點(diǎn)，觀察該界值點(diǎn)的敏感性、特異性、陽性預(yù)測值及陰性預(yù)測值，并比較Annexin A3組織表達(dá)和血清濃度診斷鉑耐藥ROC曲線下面積的大小;通過多因素生存分析觀察An

10、nexinA3組織表達(dá)對患者預(yù)后的影響并比較Annexin A3蛋白高表達(dá)組及低表達(dá)間PFS生存的差別。
　　 3、通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)觀察Cofilin-1蛋白作為鉑耐藥血清聯(lián)合預(yù)測指標(biāo)的可行性。穩(wěn)定培養(yǎng)SKOV3、SKOV3/CDDP、COC1及COC1/CDDP細(xì)胞系;檢測SKOV3/CDDP及COC1/CDDP兩株耐藥細(xì)胞系的耐藥指數(shù);通過Western Blot及免疫熒光實(shí)驗(yàn)比較Cofilin-1蛋白在耐藥及敏感細(xì)胞株中的

11、表達(dá)差異并對蛋白進(jìn)行定位研究;濃縮細(xì)胞上清并通過Western Blot觀察Cofilin-1是否在細(xì)胞上清中表達(dá)。
　　 SKOV3及耐藥株SKOV3/CDDP用DMEM(HG)培養(yǎng)基貼壁培養(yǎng)，COC1及其耐藥株COC1/CDDP用RPMI1640培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)。運(yùn)用MTT法檢測SKOV3及SKOV3/CDDP細(xì)胞株的IC50，計(jì)算SKOV3/CDDP對SKOV3的耐藥指數(shù);運(yùn)用CCK-8法檢測COC1及COC1/CDDP細(xì)胞

12、系的IC50，計(jì)算COC1/CDDP對COC1的耐藥指數(shù)。待細(xì)胞處于對數(shù)生長期時(shí)，收集細(xì)胞裂解后BCA法測定蛋白濃度，運(yùn)用Western Blot法對細(xì)胞的Cofilin-1蛋白表達(dá)水平進(jìn)行半定量檢測;通過免疫熒光法觀察Cofilin-1蛋白在爬片細(xì)胞中的定位并比較敏感及耐藥細(xì)胞中的熒光表達(dá)差別;用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清后用超濾管離心濃縮蛋白，Western Blot法檢測上清液中Cofilin-1蛋白的表達(dá)。
　

13、　 4、回顧性分析第二部分研究對象中未先期化療患者術(shù)后首次化療前后的CA125下降比率與鉑類耐藥的相關(guān)性;通過建立ROC曲線評估CA125下降比率及其和Annexin A3血清濃度聯(lián)合對鉑類耐藥的預(yù)測價(jià)值;將聯(lián)合檢測及其單因子檢測對鉑類耐藥的預(yù)測價(jià)值進(jìn)行比較。
　　 回顧性收集第二部分研究對象中未先期化療患者術(shù)后首次化療前后的CA125值，計(jì)算CA125下降比率并觀察其分布情況;比較敏感及耐藥人群中的CA125下降比率并對CA

14、125下降比率和鉑耐藥之間的相關(guān)性進(jìn)行Logistic多因素回歸分析;制作CA125下降比率預(yù)測鉑類耐藥的ROC曲線，觀察曲線下面積，并通過建立CA125下降比率和Annexin A3血清濃度預(yù)測鉑類耐藥的Logistic多因素回歸模型，繪制兩者聯(lián)合檢測的ROC曲線;將聯(lián)合檢測及單因子檢測的曲線下面積進(jìn)行比較。
　　 5、用化學(xué)發(fā)光定量檢測試劑盒檢測復(fù)發(fā)上皮性卵巢癌患者治療前血清的AnnexinA3蛋白水平;并對治療前Annex

15、in A3蛋白血清濃度和鉑化療結(jié)局的關(guān)系進(jìn)行初步探討。
　　 連續(xù)收集復(fù)發(fā)上皮性卵巢癌患者治療前的血清標(biāo)本，隨訪患者治療結(jié)局;采用化學(xué)發(fā)光定量檢測試劑盒測定復(fù)發(fā)患者的Annexin A3蛋白血清濃度并觀察其分布情況;將患者按無鉑間期長短分成兩組（＜12月VS≥12月），觀察每組患者治療前Annexin A3蛋白的血清表達(dá)水平并進(jìn)行組間比較;將有化療結(jié)局的患者按鉑化療敏感及鉑化療耐藥分組，觀察Annexin A3蛋白血清水平的組間

16、差異;觀察化療結(jié)束后不同時(shí)間點(diǎn)疾病進(jìn)展和Annexin A3蛋白血清濃度的相關(guān)性;將患者按50百分位數(shù)分成Annexin A3蛋白高濃度組及低濃度組，比較兩組間PFS生存的差別。
　　 研究結(jié)果：
　　 1、自2009年9月至2012年4月期間在北京協(xié)和醫(yī)院就診的初治上皮性卵巢癌患者96例，采用化學(xué)發(fā)光試劑盒定量檢測治療前血清的Annexin A3蛋白水平，批內(nèi)差異＜15％，批間差異＜20％。89例患者有鉑類化療結(jié)局，直

17、方圖及P-P圖顯示其Annexin A3血清濃度呈非正態(tài)分布，Kolmogorov-Smirnov Z檢驗(yàn)Z值為1.475，P值為0.026;89例患者的濃度范圍0.20 ng/mL～6.18 ng/mL，中位濃度為1.20 ng/mL，四分位間距為1.62 ng/mL。截止2013年3月，3例(3.13％)失訪，患者中位隨訪時(shí)間為14月（7月-39月）;鉑類化療敏感患者68例，鉑類化療耐藥（包括難治）患者21例。68例鉑敏感患者治療前

18、外周血Annexin A3蛋白濃度為1.33±0.91 ng/mL，顯著高于鉑耐藥患者的2.28±1.69 ng/mL(P=0.001);Logistic多因素分析顯示Annexin A3血清濃度及手術(shù)徹底性與鉑類化療耐藥/難治有顯著相關(guān)性，P值分別為0.028及0.016。治療前Annexin A3血清水平預(yù)測鉑類耐藥的ROC曲線曲線下面積為0.733，最佳界值為2.05 ng/mL時(shí)，該界值的敏感度為61.11％，特異度為80.88

19、％，陽性預(yù)測值為45.8％，陰性預(yù)測值為88.7％;擴(kuò)大樣本后的ROC曲線下面積較預(yù)實(shí)驗(yàn)略增加。Annexin A3血清高表達(dá)組(≥2.05ng/mL)的中位PFS時(shí)間較低濃度組＜2.05 ng/mL)長（14月vs11.5月），COX多因素分析顯示Annexin A3血清濃度(P=0.002)和手術(shù)徹底性(P=0.001)對PFS有顯著影響，log-rank檢驗(yàn)顯示AnnexinA3血清高濃度組及低濃度組的PFS生存差異顯著(P＜0.

20、05)。
　　 2、89例初治上皮性卵巢癌患者中38(42.7％)例Annexin A3陰性表達(dá)，30(33.7％)例表達(dá)為“+”，15(16.9％)例表達(dá)為“++”，6(6.7％)例表達(dá)為“+++”;68例(75.3％)患者低表達(dá)，21(24.7％)例患者高表達(dá)。Spearman相關(guān)性分析顯示Annexin A3組織表達(dá)和和鉑耐藥相關(guān)性顯著(P=0.012)，相關(guān)系數(shù)為0.266。鉑耐藥患者中高表達(dá)患者占42.9％,顯著高于鉑

21、敏感人群的17.6％(P=0.017)。多因素分析顯示Annexin A3組織表達(dá)（低表達(dá)&高表達(dá)，P=0.004）及手術(shù)徹底性(P=0.002)和鉑耐藥顯著相關(guān)。Annexin A3組織表達(dá)預(yù)測鉑類耐藥的ROC曲線下面積為0.664，當(dāng)Annexin A3組織表達(dá)≥++時(shí)，約登指數(shù)最大，此界值的敏感度及特異度分別為42.86％及82.35％，陽性預(yù)測值及陰性預(yù)測值分別為58.82％及87.18％。Annexin A3組織表達(dá)預(yù)測鉑耐藥

22、的ROC曲線下面積小于Annexin A3血清濃度的ROC曲線下面積，但差異無顯著性(0.664&0.773，P=0.544)。多因素生存分析顯示Annexin A3組織表達(dá)及手術(shù)徹底性對PFS影響顯著（P值分別為0.010及0.004），Annexin A3低表達(dá)組的PFS時(shí)間較高表達(dá)組長（14月vs11月），Log-rank檢驗(yàn)顯示Annexin A3高表達(dá)及低表達(dá)組間PFS生存有顯著差異(P＜0.001)。
　　 3、SK

23、OV3、SKOV3/CDDP、COC1及COC1/CDDP細(xì)胞生長狀態(tài)良好， SKOV3/CDDP對SKOV3的耐藥指數(shù)平均為6.40±1.55，COC1/CDDP對COC1的耐藥指數(shù)平均為2.87±1.16。Western blot半定量檢測顯示Cofilin1蛋白在SKOV3/CDDP耐藥細(xì)胞胞漿中的表達(dá)高于SKOV3敏感細(xì)胞株，在COC1/CDDP胞漿中的表達(dá)高于COC1細(xì)胞株，其中以SKOV3耐藥及敏感株中的Cofilin1蛋白

24、差異更為明顯。細(xì)胞免疫熒光觀察發(fā)現(xiàn)Cofilin1蛋白定位于細(xì)胞胞漿，兩種細(xì)胞系中耐藥株的熒光強(qiáng)度均較敏感株強(qiáng)。細(xì)胞培養(yǎng)上清濃縮后westem blot未檢測到Cofilin1蛋白的表達(dá)。
　　 4、第二部分研究對象中首次化療前后CA125資料完整的未先期化療卵巢癌患者61例，其中鉑敏感患者48例，鉑耐藥患者13例。61例患者CA125下降率其總體分布呈非正態(tài)分布，Kolmogorov-Smirnov Z檢驗(yàn)Z值為2.892，P

25、＜0.001。鉑耐藥患者的CA125下降比率中位數(shù)0.25顯著低于鉑敏感組的0.64(P=0.001)。去除1例極值，多因素分析顯示CA125下降比率及治療前Annexin A3血清濃度為鉑耐藥的顯著相關(guān)因素（P值分別為0.026及0.028）。CA125下降比率診斷鉑耐藥的ROC曲線下面積為0.813，最佳界值點(diǎn)為0.577，此點(diǎn)的敏感度及特異度為92.31％及61.70％，陽性及陰性預(yù)測值分別為40.0％，為96.7％。設(shè)鉑耐藥發(fā)生

26、風(fēng)險(xiǎn)值Y，建立AnnexinA3血清濃度及CA125下降率預(yù)測鉑耐藥的Logistic回歸模型LogY=-1.83+0.938×Annexin A3血清濃度-2.674×CA125變化率，Y值診斷鉑耐藥的ROC曲線下面積為0.863，最佳界值點(diǎn)的敏感度及特異度分別為92.31％及74.47％，陽性及陰性預(yù)測值分別為50.0％及97.2％。該聯(lián)合檢測的ROC曲線下面積大于Annexin A3血清濃度單因子預(yù)測的曲線下面積(0.863&0.

27、745)，P值為0.053。
　　 5、納入符合標(biāo)準(zhǔn)的的復(fù)發(fā)性上皮性卵巢癌患者61例，其中54例無鉑間期≥6月，7例無鉑間期＜6月。鉑化療難治性患者9例，鉑類化療耐藥患者8例，鉑類化療敏感患者7例?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測治療前Annexin A3蛋白血清濃度板內(nèi)變異系數(shù)小于15％，板間變異系數(shù)小于20％。直方圖及P-P圖提示Annexin A3蛋白血清濃度呈正態(tài)分布(Z=265，P=.082)，平均濃度為0.77±0.56 ng/mL。

28、Spearman相關(guān)性分析顯示治療前Annexin A3血清濃度和鉑類化療耐藥無顯著相關(guān)性，P值為0.517。無鉑間期＜12月及≥12月的患者平均濃度為0.92±0.60 ng/ml及0.67±0.50ng/ml，差異無顯著性(P=0.08)。17例例鉑耐藥患者的中位Annexin A3血清濃度高于7例鉑敏感患者（0.87ng/mL vs0.67ng/mL），但組間差異無顯著性(P=0.314)。化療結(jié)束各時(shí)間點(diǎn)疾病進(jìn)展患者的血清濃度高

29、于疾病無進(jìn)展患者血清濃度，差別無顯著性。Annexin A3蛋白高濃度組的中位PFS時(shí)間較低濃度組短（6月vs7月），PFS生存比較無顯著差異(P=0.09)。
　　 結(jié)論：
　　 1、初治上皮性卵巢癌患者的外周血Annexin A3蛋白表達(dá)水平和鉑耐藥相關(guān)性顯著，對臨床鉑類耐藥有中等預(yù)測價(jià)值，最佳界值為2.05ng/mL。Annexin A3血清濃度及手術(shù)徹底性對鉑類耐藥及無進(jìn)展生存均有顯著的影響。
　　 2、

30、初治上皮性卵巢癌患者腫瘤組織的Annexin A3蛋白表達(dá)和鉑耐藥顯著相關(guān)，對鉑耐藥預(yù)測價(jià)值低;Annexin A3蛋白組織表達(dá)預(yù)測鉑類耐藥的ROC曲線下面積小于Annexin A3血清濃度，但差異無顯著性;Annexin A3蛋白組織表達(dá)是無進(jìn)展生存的顯著影響因素。
　　 3、體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)Cofilin-1蛋白和鉑類耐藥相關(guān)，但是不具有細(xì)胞外泌性，因此不能作為鉑類耐藥預(yù)測的血清聯(lián)合檢測指標(biāo)。
　　 4、CA125下