稻縱卷葉螟信息素結(jié)合蛋白的免疫定位及結(jié)合特性分析.pdf

1、嗅覺在昆蟲的行為活動中起著不可或缺的作用，如在尋找寄主、識別配偶、選擇產(chǎn)卵場所等方面都有著重要意義。氣味結(jié)合蛋白OBPs(含信息素結(jié)合蛋白PBPs)在嗅覺識別過程中運(yùn)輸氣味分子方面起著一定作用，但其具體功能仍不明確。如果能清楚昆蟲的嗅覺機(jī)制，將有助于害蟲的監(jiān)測和防治方面的研究。本課題以水稻重要害蟲稻縱卷葉螟Cnaphalocrocis medinalis(Guenée)為研究對象，在對其PBPs原核表達(dá)及重組PBPs純化的基礎(chǔ)上，通過免

2、疫化學(xué)細(xì)胞定位技術(shù)觀察并分析了PBPs在觸角感器中的準(zhǔn)確分布，利用熒光競爭結(jié)合技術(shù)分析了重組PBPs與不同配基的結(jié)合特性及與pH值的相關(guān)性。主要取得的研究結(jié)果如下:
　　1、稻縱卷葉螟信CmedPBP4的原核表達(dá)與蛋白純化
　　依據(jù)實(shí)驗室已經(jīng)建立的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，將之前PCR獲得全長的CmedPBP4基因序列重新構(gòu)建原核表達(dá)載體并進(jìn)行表達(dá)(GenBank登錄號為KC507185，其開放閱讀框全長為444bp，編碼147個氨基酸，

3、分子量16.4 kDa)，利用包涵體變復(fù)性的方法將對存在于沉淀的重組蛋白進(jìn)行處理，獲得大量重組蛋白，利用DE52弱陰離子交換層析柱和Q-Sepharose Fast Flow強(qiáng)陰離子交換層析柱對重組蛋白進(jìn)行純化回收，用于制備多克隆抗體和熒光結(jié)合特性分析。
　　2、稻縱卷葉螟CmedPBP4在觸角感器的免疫定位
　　利用純化的CmedPBP4作為抗原，制備相應(yīng)的多克隆抗體，通過免疫印跡試驗檢測抗體的特異性，條帶的分子量在16.

4、4kDa左右，說明所得為CmedPBP4的抗體;另外通過與不同組織蛋白進(jìn)行Western Blot發(fā)現(xiàn)，CmedPBP4抗體僅與稻縱卷葉螟雌雄成蟲觸角組織蛋白有特異性反應(yīng)，而且后者更明顯。
　　結(jié)合掃描電鏡和透射電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)CmedPBP4僅在有厚壁的毛形感器的淋巴液中有標(biāo)記即僅分布于毛形感器中，可能與感受性信息素有關(guān)。
　　3、稻縱卷葉螟CmedPBP4的結(jié)合特性分析
　　以1-NPN為探針，分別研究了在酸性和中性

5、緩沖液條件下CmedPBP4與41種不同配基（含4種性信息素物質(zhì)和37種水稻揮發(fā)物）的結(jié)合特性。結(jié)果表明，在酸性條件下，CmedPBP4與不同配基的結(jié)合特性要明顯低于中性條件;pH=7.4時， CmedPBP4與3種性信息素物質(zhì)(Z13-18∶Ac，Z11-16∶Al和Z13-18∶OH)及水稻揮發(fā)物中的環(huán)己醇、橙花叔醇、柏木腦、月桂醛、紫羅蘭酮、(-)-α-雪松烯、(Z)-法尼烯、trans-石竹烯、R-(+)-檸檬烯、(-)-檸檬烯