毛果楊PtrWRKY73轉(zhuǎn)錄因子在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的抗病及抗旱研究.pdf

1、楊樹(shù)是一種具有重要工業(yè)價(jià)值的經(jīng)濟(jì)林木，多用于造紙、橡膠生產(chǎn)和家具制造。楊樹(shù)生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，常常遭受不同的生物與非生物脅迫，包括各種各樣的病原菌如真菌和細(xì)菌，以及干旱、鹽堿等。近年，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，采用基因工程的手段對(duì)楊樹(shù)進(jìn)行改良，從而獲得抗病優(yōu)良品種，已成為楊樹(shù)分子育種的新策略。研究表明，植物WRKY轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與了抗病、抗旱反應(yīng)，但關(guān)于楊樹(shù)中WRKY轉(zhuǎn)錄因子的研究還比較少。因此，篩選楊樹(shù)中參與抗病及抗旱過(guò)程的WRKY轉(zhuǎn)錄因子，闡明

2、其生物學(xué)功能，不僅可揭示植物抗病和抗旱過(guò)程的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，還可為培育抗病、抗旱的楊樹(shù)新品種提供參考。
　　本研究從毛果楊中分離克隆得到PtrWRKY73基因，該基因受茉莉酸甲酯(Methyl jasmonic acid)、水楊酸(Salicylic acid)、潰瘍病(Dothiorella greariasaccSacc.)、氯化鈉(NaCl)、聚乙二醇6000(PEG-6000)的誘導(dǎo)。PtrWRKY73蛋白含有兩個(gè)WRKY結(jié)

3、構(gòu)域，屬于WRKYⅠ家族，同時(shí)，由于其N端存在D域和SP集群，暗示PtrWRKY73可能參與了蛋白的磷酸化。組織表達(dá)譜分析表明，PtrWRKY73主要在根、老葉、芽和莖表達(dá)，特別是在韌皮部的表達(dá)量尤為高。亞細(xì)胞定位試驗(yàn)顯示PtrWRKY73蛋白在細(xì)胞核中積累，酵母單雜交試驗(yàn)證明PtrWRKY73蛋白能夠激活報(bào)告基因的表達(dá)，具有轉(zhuǎn)錄激活活性，上述結(jié)果表明PtrWRKY73蛋白是一個(gè)轉(zhuǎn)錄激活因子。在擬南芥中超量表達(dá)PtrWRKY73，抗病分

4、析顯示，轉(zhuǎn)基因植物對(duì)活體寄生型細(xì)菌丁香假單胞菌番茄致病變種(Pseudomonassyringae pv.tomato(Pst) DC3000)的抗病性得到了顯著的提高，但對(duì)腐生型真菌灰霉菌(Botrytis cinerea)敏感性增強(qiáng)。在分子水平上檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因擬南芥中SA途徑介導(dǎo)的抗病相關(guān)基因(PR1、PR2和PAD4)的表達(dá)量顯著上調(diào)。以上結(jié)果表明，PtrWRKY73正向調(diào)控了SA介導(dǎo)的抗病途徑，增強(qiáng)植物對(duì)活體寄生型病原菌的抗性

5、，而對(duì)腐生型病原菌的敏感性增加。
　　同時(shí)發(fā)現(xiàn)，過(guò)量表達(dá)PtrWRKY73的轉(zhuǎn)基因擬南芥相對(duì)野生型具有更強(qiáng)的耐旱性。對(duì)四周齡的擬南芥進(jìn)行干旱處理發(fā)現(xiàn)，野生型擬南芥葉片枯萎程度嚴(yán)重，而轉(zhuǎn)基因植株葉片枯萎程度較輕，僅表現(xiàn)出輕微發(fā)紅。進(jìn)一步分別統(tǒng)計(jì)了野生型和轉(zhuǎn)基因植株L47和L49的氣孔寬長(zhǎng)比，分別為0.295131、0.141165和0.182188，同時(shí)，統(tǒng)計(jì)了野生型和轉(zhuǎn)基因植株L47和L49單位面積內(nèi)氣孔的數(shù)量，分別為175.77

6、4、158.3892和137.6774。這些數(shù)據(jù)表明轉(zhuǎn)基因植株不僅氣孔寬長(zhǎng)比明顯小于野生型，單位面積內(nèi)氣孔的數(shù)量也顯著少于野生型。以上結(jié)果揭示PtrWRKY73通過(guò)使轉(zhuǎn)基因擬南芥氣孔開(kāi)口減小、氣孔數(shù)量減少，增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因植株的抗旱性。在分子水平檢測(cè)了PtrWRKY73過(guò)量表達(dá)植株中抗旱相關(guān)基因的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)脅迫相關(guān)的標(biāo)記基因RD29A、ABA合成途徑的關(guān)鍵酶基因NCED3和脫水蛋白編碼基因RAB18均顯著上調(diào)。
　　上述研究結(jié)果表