白樺BpMYB106轉(zhuǎn)錄因子的功能研究.pdf

1、白樺（Betula platyphylla Suk.）是我國(guó)東北及內(nèi)蒙古四省區(qū)主要分布的樹(shù)種之一，在當(dāng)?shù)厥侵匾脑炝謽?shù)種。由于自樺的重要生態(tài)、觀賞和非常實(shí)用的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，目前對(duì)它的遺傳改良的范圍也漸漸擴(kuò)大，主要的改良目的是培育速生、優(yōu)質(zhì)、高光效、高抗的新品種。在天然白樺所具有的優(yōu)勢(shì)上利用分子生物學(xué)手段進(jìn)行高光效、速生白樺的品種創(chuàng)制，不但在林木分子生物學(xué)研究提供理論基礎(chǔ)，更加重要的是可以獲得經(jīng)濟(jì)性狀上更具優(yōu)勢(shì)的白樺，為林木新品種創(chuàng)制提供材料

2、。本研究通過(guò)轉(zhuǎn)基因手段在白樺中過(guò)表達(dá)MYB家族中的一個(gè)新的基因Bp MYB106，對(duì)轉(zhuǎn)基因白樺進(jìn)行分子生物學(xué)及生理上的檢測(cè)，并對(duì)其下游基因進(jìn)行概括分析，來(lái)探討該基因的相關(guān)功能，從而對(duì)篩選高光效、高生長(zhǎng)速率的白樺優(yōu)質(zhì)品種提出一定參考。研究結(jié)果如下：
　　1.從白樺中克隆得到BpMYB106基因，經(jīng)過(guò)氨基酸多序列比較分析確定該基因?qū)儆赗2R3 MYB基因家族，且序列與擬南芥、楊樹(shù)、玉米等物種的參與光合作用及毛狀體發(fā)育相關(guān)調(diào)控的MYB基

3、因具有一定的相似度，因此推測(cè)BpMYB106基因與白樺的光合作用相關(guān)功能及毛狀體發(fā)育相關(guān)。
　　2.利用熒光定量PCR技術(shù)對(duì)該基因進(jìn)行表達(dá)模式分析，在白樺根、莖、葉、莖尖中，該基因在莖尖和葉片顯著表達(dá)，說(shuō)明該基因在白樺的莖尖和葉片中具有組織表達(dá)特異性。
　　3.構(gòu)建pBI121-BpMYB106-GFP融合表達(dá)載體，利用基因槍瞬時(shí)轉(zhuǎn)化技術(shù)對(duì)洋蔥表皮細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)化，確定該基因定位在細(xì)胞核中。
　　4.通過(guò)染色體步移技術(shù)

4、克隆了Bp MYB106基因上游啟動(dòng)子1573 bp，對(duì)該序列的順式作用元件分析表明，該序列含有大量與光響應(yīng)及MYB相關(guān)的結(jié)合位點(diǎn)。將基因起始位點(diǎn)以上1500 bp的序列定向替換pBI121-GUS表達(dá)載體上的CaMV35S啟動(dòng)子，構(gòu)建融合載體pMYB-GUS，進(jìn)行白樺各個(gè)時(shí)期的瞬時(shí)侵染。結(jié)果表明白樺在長(zhǎng)出新葉（莖尖）時(shí)，在新葉的GUS活性顯著，另外在老葉的毛狀體中GUS活性顯著。這一結(jié)果表明該基因在莖尖及葉片毛狀體中表達(dá)活躍，與該基因

5、在白樺中表達(dá)模式的結(jié)果一致。
　　5.構(gòu)建pROKⅡ-BpMYB106過(guò)表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對(duì)白樺進(jìn)行轉(zhuǎn)化，通過(guò)分子檢測(cè)獲得11個(gè)陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因株系;通過(guò)生理水平檢測(cè)，確定過(guò)表達(dá)株系白樺的葉片毛狀體密度、生長(zhǎng)速率、瞬時(shí)光合速率及蒸騰速率高于野生型白樺，但氣孔形態(tài)和數(shù)量、失水率差異不顯著(P＞0.05)。
　　6.用轉(zhuǎn)基因白樺的成熟葉片作為樣品，野生型白樺成熟葉片作為對(duì)照，進(jìn)行表達(dá)譜實(shí)驗(yàn)，與野生型白樺相比，轉(zhuǎn)基因白樺具有99

6、2個(gè)差異基因，其中上調(diào)表達(dá)基因508條，下調(diào)表達(dá)基因484條。經(jīng)Pathway分析，表達(dá)譜中具有12個(gè)與光合作用和氧化磷酸化相關(guān)的差異基因，除此以外差異基因中還具有谷氧還蛋白、植物病原互作、生長(zhǎng)素、苯丙素合成、類黃酮生物合成等相關(guān)基因。
　　7.對(duì)光合作用、氧化磷酸化作用、生長(zhǎng)素相關(guān)基因進(jìn)行啟動(dòng)子作用元件分析，均發(fā)現(xiàn)MYB特異結(jié)合位點(diǎn)及基因相應(yīng)功能的作用元件，光合作用基因具有關(guān)鍵酶rbcS一致序列和光調(diào)控基因上游保守序列Ⅰbox/

7、Ⅰbox core，氧化磷酸化基因具有T box、BoxⅡ和SORLIPs元件，生長(zhǎng)素基因具有ARF元件。對(duì)類黃酮生物合成途徑進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)6個(gè)上調(diào)表達(dá)基因分別編碼類黃酮3'-羥化酶(F3'H)、類黃酮3'，5'-羥化酶(F3'5'H)、二羥黃酮醇4-還原酶(DFR)、無(wú)色花色素4-還原酶(LAR)及有色花色素經(jīng)花色素還原酶(ANR)，1個(gè)下調(diào)表達(dá)基因編碼查爾酮合酶(CHS)，這些酶均是類黃酮生物合成的關(guān)鍵酶;該途徑的上游代謝途徑苯丙素

8、生物合成的一部分中，參與差異表達(dá)的有4個(gè)基因，分別編碼苯丙氨酸解氨酶(PAL)和4-香豆酸-CoA連接酶(4CL)，這些基因均是生成類黃酮生物合成底物香豆酰-CoA的關(guān)鍵酶。
　　8.選取表達(dá)譜中光合作用和氧化磷酸化的12個(gè)差異表達(dá)基因的啟動(dòng)子順式作用元件——5個(gè)MYB元件，分別為MYB1AT、MYB2AT、MYBCORE、MYBST1和MYBZM，3個(gè)光響應(yīng)元件分別為SORLIP2、BoxⅡ和RBCS，將這些元件分別串連三次重復(fù)