FHA結構域調控蛋白GarA通過改變氨基酸組分調控基因組在UV和氧化脅迫下的穩(wěn)定性.pdf

1、結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）引起的結核病嚴重威脅著人類健康，每年有上百萬的人感染結核病，已經成為死亡率僅次于艾滋病的全球第二大傳染病。在世界衛(wèi)生組織WHO已經發(fā)布了最新的《2013年全球結核病報告》中指出:2012年新增結核病860萬例，其中死亡人數(shù)到達了130萬。其主要由于多重耐藥菌和廣泛耐藥菌的出現(xiàn)，以及HIV的共感染，使得結核病形勢更加嚴峻。因此，對結核病的致病菌——結核分枝桿菌的深

2、入研究迫在眉睫。
　　在各種環(huán)境脅迫下維持基因組的穩(wěn)定性是生物生存和繁殖的關鍵。結核菌是人類重大傳染疾病結核病的致病菌。在分枝桿菌長期的進化過程中，又會遭遇各種環(huán)境壓力的選擇作用，比如:紫外線照射。結核分枝桿菌為了在巨噬細胞和肉芽腫中存活，必須適應有氧化壓力。紫外線會使生物體DNA上兩個相連的胸腺嘧啶形成胸腺嘧啶二聚體，使DNA鏈發(fā)生斷裂，使復制酶無法工作，從而對生物體造成損傷。氧化壓力是生物在有氧環(huán)境生存必須面對的一種壓力條件，

3、通過影響Ca2+濃度引起DNA的損傷[5]。但是，在這么多不利條件下，結核分枝桿菌的基因組一直保持非常穩(wěn)定，那么維持基因組的穩(wěn)定性在分枝桿菌適應外界壓力環(huán)境和侵染宿主細胞的過程中就顯得非常重要。
　　有關研究表明:分枝桿菌進化出了一系列的修復和耐受機制來抵抗UV給DNA帶來的損傷。分析結核分枝桿菌基因組表明:其基因組含有DNA修復系統(tǒng)，比如:DNA損傷修復、核算切除修復(NER)、基礎切除修復(BER)、重組修復、非同源末端連接、

4、SOS修復等。為了抵抗巨噬細胞和肉芽腫，結核分枝桿菌也具有抵抗活性氧調節(jié)的機制。在革蘭氏陰性菌中，OxyR蛋白是抵抗氧化壓力重要的組成成分。OxyR是活性氧簇感應器，同時也是一個轉錄因子，包括去毒酶（過氧化氫酶和氫過氧化物酶）和alkyl氫過氧化物酶。雖然這幾十年來對結核分枝桿菌的研究不斷深入，維持基因組穩(wěn)定性仍然有很多地方還有待研究。
　　FHA的全稱為forkhead-associated domain，是叉頭相關結構域，是許

5、多調控蛋白的磷酸肽識別結構域。包含有FHA結構域的蛋白涉及許多細菌生長代謝的過程，包括細胞形態(tài)的調節(jié)、三型分泌系統(tǒng)、孢子形成、碳水化合物的儲存、轉運、信號轉導和乙胺丁醇耐受以及致病菌與宿主之間的相互關系。在真核生物中，許多包含有FHA結構域的蛋白分布在細胞核，參與細胞周期檢驗點的形成和維持，DNA修復和轉錄調控。
　　本文研究的GarA蛋白(MSMEG_3647)是典型的含有磷酸化識別FHA結構域的調控蛋白。有研究表明，未磷酸化G

6、arA蛋白能與α-酮戊二酸脫羧酶(KGD)、依賴NAD的谷氨酸脫氫酶(GDH)、谷氨酸合酶的活性(GS)相結合并對其的活性產生影響[10]。在結核分枝桿菌中，GarA蛋白作為一個典型的FHA結構域調控蛋白怎么可能只參與代謝功能的調控呢？本文利用Himarl轉座子插入突變庫，成功篩選了本文篩選到了一株GarA（MSMEG_3647）蛋白突變的恥垢分枝桿菌M.smegmatisΔ GarA，其菌落形態(tài)與M.smegmatis mc2155相

7、比明顯變得光滑，單菌落形態(tài)減小、疏水性系數(shù)明顯增高，生物膜形態(tài)也發(fā)生變化。這表明:GarA(MSMEG_3647)蛋白突變會引起細胞壁脂質成分的變化。我們的實驗還證明了GarA(MSMEG_3647)蛋白突變的恥垢分枝桿菌M.smegmatisΔ GarA對紫外線照射耐受及對H2O2敏感，其可能是與基因組穩(wěn)定性相關。我們還發(fā)現(xiàn)了菌體內游離氨基酸代謝及組分也發(fā)生了改變。本研究發(fā)現(xiàn)了一種UV和氧化壓力應激的新型分子機制:GarA蛋白缺失會引