維持耐輻射球菌基因組穩(wěn)定性的關(guān)鍵基因recQ的功能及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究.pdf

1、耐輻射球菌(Deinococcus radiodurans)是迄今為止發(fā)現(xiàn)的對電離輻射、紫外線、干燥、過氧化氫等一些DNA損傷劑都具有極強(qiáng)抗性的微小球菌，它在DNA雙鏈斷裂修復(fù)上具有超強(qiáng)的能力，是目前研究DNA損傷與修復(fù)的模式生物。從1999年Deinococcus radiodurans野生株R1全基因組數(shù)據(jù)公布以來，該細(xì)菌的分子結(jié)構(gòu)特征研究，分子防御機(jī)制方面和重要修復(fù)基因，如recA、ssb、pprI,pprA等在DNA修復(fù)機(jī)制方面

2、都取得了很大的進(jìn)展，但還未能清楚揭示耐輻射球菌的修復(fù)機(jī)理。 RecQ解螺旋酶是解螺旋酶在進(jìn)化中高度保守的一個亞族，它在維持有機(jī)體基因組的穩(wěn)定性中有重要的作用。耐輻射球菌具有兩個特殊結(jié)構(gòu)的RecQ家族成員：DR1289和DR2444，這兩個基因在該細(xì)菌中的具體功能都未知。本文主要系統(tǒng)地研究這兩個基因在耐輻射球菌中的作用機(jī)制和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，具體從以下幾個方面進(jìn)行了研究： 1．先運(yùn)用生物信息學(xué)的方法確定這兩個基因在染色體上的具體位

3、置，對DR1289和DR2444進(jìn)行了結(jié)構(gòu)域的同源性分析，功能預(yù)測和進(jìn)化樹分析，結(jié)果表明DR1289與細(xì)菌及真核生物有較近的親緣關(guān)系，而DR2444相差較遠(yuǎn)。 2．運(yùn)用PCR突變?nèi)芜B接法克隆具有自身groEL啟動子、KAT啟動子分別與卡那霉素抗性基因、氯霉素抗性基因融合的DNA片段反向重組到基因組中，構(gòu)建并鑒定了卡那霉素抗性完全突變株△DR1289，氯霉素抗性完全突變株△DR2444，雙突變株△recO。輻射條件下和H<,2>

4、O<,2>氧化壓力下突變株生存率結(jié)果表明：△DR2444與R1存活率趨勢線基本一致，而△DRl289和△recQ雙突變株較為敏感。根據(jù)上述結(jié)果推測，DR1289是一個對R1保持極端抗性的必需基因，而DR2444是非必需基因。 3．分析了突變株△DR1289的一些特性，表型數(shù)據(jù)表明，敲除掉DR1289這個基因后，突變株對UV，絲裂霉素C，過氧化氫都極敏感，對γ-輻射在超過2 kGy劑量下敏感?！鱀R1289生長與野生株相比較為緩慢

5、；脈沖場電泳表明，無論在正常生長狀況，還是過氧化氫脅迫條件下，該突變株都具有基因組的不穩(wěn)定性，尤其是在20 mM H<,2>O<,2>處理30分鐘后，其基因組圖譜與R1在高劑量輻射和長期干燥脅迫下的圖譜很相似。運(yùn)用穿梭質(zhì)粒pRADK進(jìn)行DR1289各個結(jié)構(gòu)域的功能性補(bǔ)償，表明helicase結(jié)構(gòu)域和3個串聯(lián)的HRDC結(jié)構(gòu)域都必不可少。 4．用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)體外表達(dá)了DR1289各個結(jié)構(gòu)域的突變蛋白，并進(jìn)行了純化。我們使用熒光染

6、料H33258，長度為2.7 kbp的線性化雙鏈(HindⅢ-pUC19)片斷作為底物的熒光染色替代法檢測解螺旋酶活性。不同ATP和金屬離子濃度下該蛋白的解螺旋酶活性表明，DR1289的解螺旋酶活性至少與曾經(jīng)報(bào)道過的大腸桿菌的RecQ活性相當(dāng)。SSB蛋白作為一個解螺旋酶功能促進(jìn)因子，我們發(fā)現(xiàn)DRl289解螺旋速率能夠被D.radiodurans SSB蛋白提高，且對DR1289蛋白有相同物種專一性的特殊效應(yīng)。ATPase活性表明heli

7、case結(jié)構(gòu)域?qū)R1289 ATPase是必需的，而HRDC結(jié)構(gòu)域是達(dá)到最適ATPase酶活性所必需的結(jié)構(gòu)域。基于這些實(shí)驗(yàn)，我們推測在耐輻射球菌中，DRl289的C-末端三個串聯(lián)的HRDC結(jié)構(gòu)域已經(jīng)進(jìn)化，從而應(yīng)對各種類型的DNA損傷。 5．在DR1289刪除以后，全基因組轉(zhuǎn)錄譜水平約有9.1％發(fā)生了2倍以上的改變，如鐵離子的代謝，氧化相關(guān)基因和細(xì)胞分裂相關(guān)基因。另外，在20mM H<,2>O<,2>壓力下，突變株許多重要基因如

8、recA，pprA，ddrA，DR0003，DR0070的轉(zhuǎn)錄水平變化趨勢與野生株在強(qiáng)劑量輻射和長期干燥條件下的趨勢很相象。Western blot分析表明無論在有氧化脅迫條件，還是在正常生長條件下，突變株中RecA水平都上升，表明當(dāng)DR1289刪除后，體內(nèi)確實(shí)存在較大的DNA損傷，進(jìn)一步佐證了芯片數(shù)據(jù)。高錳低鐵可以促使耐輻射球菌的抗性提高，但I(xiàn)CP-MS測定結(jié)果顯示DR1289突變體內(nèi)全鐵含量上升，而全錳含量下降，導(dǎo)致Mn/Fe比例從

9、0.38下降到0.07。而順磁共振實(shí)驗(yàn)表明突變株中的自由鐵量約為野生株的50％。綜上所述，DR1289基因是一個維持耐輻射球菌基因組穩(wěn)定性和貢獻(xiàn)于極端抗性的關(guān)鍵基因。 6．為了進(jìn)一步研究耐輻射球菌DRl289蛋白在極端抗性中的調(diào)控機(jī)制，通過二維液相色譜ProteomeLab PF 2D目標(biāo)蛋白快速分離系統(tǒng)分析了野生株R1與功能破壞株△DR1289在20 mM H<,2>O<,2>氧化壓力下蛋白表達(dá)譜的差異。 綜上所述，耐