單一必需氨基酸調(diào)控乳蛋白合成機(jī)制的研究.pdf

1、近年來的研究結(jié)果表明，氨基酸不僅是蛋白質(zhì)合成的底物，而且能夠作為生物信號(hào)直接參與蛋白質(zhì)合成的調(diào)節(jié)。為研究必需氨基酸（EAA）通過細(xì)胞內(nèi)信號(hào)途徑調(diào)控乳蛋白合成的機(jī)制，本文以牛乳腺上皮細(xì)胞系（MAC-T）為材料，系統(tǒng)研究了10種EAA對(duì)調(diào)控乳蛋白合成關(guān)鍵信號(hào)途徑的影響，以泌乳小鼠為模型，以仔鼠體增重衡量蛋白合成速率研究了調(diào)控乳蛋白合成潛力EAA對(duì)泌乳的影響及機(jī)制。
　　單一EAA對(duì)調(diào)控乳蛋白合成關(guān)鍵信號(hào)蛋白磷酸化程度的影響。本試驗(yàn)以M

2、AC-T為試驗(yàn)材料，試驗(yàn)處理為在依次缺失一種EAA的DMEM/F12培養(yǎng)基上培養(yǎng)，以含有全部EAA的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)為正對(duì)照，以缺失全部EAA的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)為負(fù)對(duì)照。分別缺失10種EAA對(duì)蛋白合成過程中主要信號(hào)蛋白磷酸化程度有極顯著影響，負(fù)對(duì)照 mTOR磷酸化程度下降58％，缺失Met、Ile或Val使 mTOR磷酸化程度分別下降38%、41%、42%；單一EAA缺失降低細(xì)胞內(nèi)4eBP1的磷酸化程度，其中缺失Me

3、t、Ile、Thr和Lys分別下降39%、41%、36%和42%；缺失Met、Ile、Leu、Val時(shí)S6K1的磷酸化程度分別下降33%、38%、41%、40%；單一EAA缺失顯著提高eEF2磷酸化程度，其中缺失Met、Lle、Val磷酸化程度分別提高18%、20%、18%；缺失所有EAA和Met eIF2α磷酸化程度分別提高49%和39%。結(jié)果表明，單一EAA主要影響細(xì)胞內(nèi)mTOR和GCN22條通路中關(guān)鍵信號(hào)蛋白的磷酸化，且關(guān)鍵信號(hào)蛋

4、白對(duì)完全缺失Met、Leu、Ile、Thr、Val、Lys反應(yīng)敏感。
　　Met、Leu、Ile、Val對(duì)調(diào)控乳蛋白合成關(guān)鍵信號(hào)蛋白的影響。為研究信號(hào)蛋白反應(yīng)敏感EAA的作用效果，以MAC-T為試驗(yàn)材料，首先研究不同濃度EAA對(duì)調(diào)控蛋白合成關(guān)鍵信號(hào)蛋白的影響以確定細(xì)胞內(nèi)EAA缺乏狀態(tài)，EAA缺乏時(shí)添加Met、Leu、Ile、Val以及這四種EAA兩兩組合。隨著EAA濃度的變化信號(hào)蛋白磷酸化程度符合米氏方程變化趨勢，EAA濃度20%

5、以下信號(hào)蛋白磷酸化程度變化幅度較大，當(dāng)EAA濃度在30%-90%之間信號(hào)蛋白的磷酸化程度變化趨于穩(wěn)定，據(jù)此確定10%為后續(xù)研究EAA缺乏狀態(tài)的濃度。EAA缺乏狀態(tài)添加Met、Leu、Ile、Val以及這四種EAA兩兩組合，添加Leu、Ile、Met和Leu、Met和Ile、Leu和Ile mTOR磷酸化程度分別提高47%、69%、187%，200%和165%；單獨(dú)添加Leu、Ile、Val提高4eBP1的磷酸化程度，且同時(shí)添加Met和L

6、eu、Leu和Ile、Val和Ile有加性效果；添加Ile S6K1磷酸化程度提高63%，且Ile與其他三種氨基酸組合有加性作用。結(jié)果表明，EAA缺乏時(shí)添加Met、Leu、Ile、Val影響提高mTOR通路中信號(hào)蛋白的磷酸化程度，且四種氨基酸兩兩組合對(duì)信號(hào)蛋白的磷酸化有疊加作用。
　　Leu、Ile、Met、Thr對(duì)泌乳小鼠乳蛋白合成的影響。為評(píng)估體外試驗(yàn)中乳蛋白合成調(diào)控潛力EAA對(duì)泌乳的貢獻(xiàn)及作用機(jī)制，首先確定小鼠蛋白缺乏狀態(tài)，

7、建立仔鼠體增重和不同蛋白水平的反應(yīng)曲線，試驗(yàn)選取分娩日期相近的孕鼠，日糧蛋白水平分別為6%、9%、12%、15%、18%、21%、24%,和27%。當(dāng)?shù)鞍姿降陀?1%時(shí)，隨蛋白濃度的增加仔鼠體增重增加，仔鼠體增重隨蛋白水平的提高成米氏反應(yīng)趨勢，最大體增重一半時(shí)的蛋白水平為14%，最大體增重為113g；隨日糧蛋白水平提高泌乳小鼠乳腺組織中S6K1磷酸化程度提高，eEF2的磷酸化程度降低。根據(jù)以上結(jié)果，確定15%為日糧低蛋白，即負(fù)對(duì)照，2

8、1%為日糧高蛋白，即正對(duì)照，低蛋白基礎(chǔ)上分別添加Met、Leu、Ile、Thr。低蛋白日糧添加Met、Leu、Ile仔鼠體增重分別提高10%、11%、9%；添加Met、Leu、Ile和Thr后泌乳小鼠乳腺組織中mTOR的磷酸化程度分別提高了55%、34%,、47%和45%；必需氨基酸處理提高泌乳小鼠血漿IGF-1的濃度；仔鼠窩增重和乳腺組織中mTOR，相關(guān)系數(shù)為0.40。結(jié)果表明，低蛋白日糧添加Met、Leu、Ile獨(dú)立刺激乳蛋白合成速

9、率（仔鼠窩增重），且主要通過mTOR信號(hào)通路。
　　Met、Leu誘導(dǎo)內(nèi)分泌變化對(duì)泌乳的影響。初探泌乳潛力EAA（Met、Leu）誘導(dǎo)內(nèi)分泌的變化對(duì)泌乳的影響機(jī)制，本試驗(yàn)以泌乳小鼠為模型，以仔鼠體增重衡量蛋白合成速率，低蛋白日糧添加Met、Leu。Met、Leu提高泌乳小鼠仔鼠體增重；添加Met提高泌乳小鼠血漿胰島素水平，Met、Leu提高血漿中IGF-1水平，提高乳腺組織中Akt的磷酸化程度；Met明顯增加泌乳小鼠胰腺中胰島素分

10、泌和肝臟中IGF-1的分泌，且Met、Leu引起的肝臟差異基因主要富集在胰腺分泌和胰島素信號(hào)途徑。
　　綜上，在體外，單一EAA主要影響細(xì)胞內(nèi)mTOR和GCN2通路中關(guān)鍵信號(hào)蛋白的磷酸化，Met、Leu、Ile、Val對(duì)細(xì)胞內(nèi)控制蛋白合成關(guān)鍵信號(hào)蛋白的磷酸化有單獨(dú)和疊加作用；在體內(nèi)，蛋白缺乏日糧補(bǔ)充Met、Leu、Ile獨(dú)立刺激乳蛋白合成速率（仔鼠窩增重），可見“木桶理論”不適用于泌乳動(dòng)物，且Met、Leu、Ile對(duì)乳蛋白合成速率