SIRT7基因啟動(dòng)子與其蛋白穩(wěn)定性的調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、在酵母中，染色體沉默因子Sir2(silentinformationregulator-2)是NAD+依賴的組蛋白去乙酰化酶，它參與了基因組穩(wěn)定和衰老等多種生理過程[1-2]。Sir2在哺乳動(dòng)物中有七個(gè)家族成員(SIRT1-SIRT7)[3]。近年來(lái)，大量研究表明Sirtuin家族成員廣泛參與凋亡，應(yīng)激，分化，衰老，基因表達(dá)等多種生理過程[4]。SIRT7是這個(gè)家族中唯一定位于細(xì)胞核仁的蛋白[5]。也是到目前為止，唯一沒有被鑒定出酶活性

2、的家族成員。SIRT7是Poll聚合酶的活化子，能夠促進(jìn)rDNA轉(zhuǎn)錄。研究表明在乳腺癌和甲狀腺癌中SIRT7mRNA高表達(dá)，提示SIRT7可能參與癌癥的發(fā)生過程。因此研究SIRT7基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制對(duì)于我們了解SIRT7在腫瘤發(fā)生，應(yīng)激等生理過程中的作用具有重要意義。
　　 本文主要研究了SIRT7的啟動(dòng)子和SIRT7蛋白穩(wěn)定性調(diào)控機(jī)制，以及SIRT7在細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位，并嘗試鑒定了SIRT7的組蛋白與非組蛋白的去乙?；富钚?/p>

3、。
　　 1、SIRT7mRNA的表達(dá)譜
　　 我們通過Northemblotting和RT-PCR在mRNA水平檢測(cè)了SIRT7在小鼠主要組織和幾種人漂細(xì)胞系中的表達(dá)，結(jié)果顯示SIRT7在小鼠組織中廣泛表達(dá)，其中在肝臟組織中表達(dá)最為豐富。在人胚腎細(xì)胞HEK293T，MCF7，Huh7，HepG2，HeLa細(xì)胞中SIRT7均有表達(dá)，在肺癌細(xì)胞H1299中幾乎不表達(dá)。
　　 2、5’-RACE確定SIRT7轉(zhuǎn)錄起始

4、位點(diǎn)
　　 提取小鼠肝臟和人急性白血病細(xì)胞HL60RNA，利用SIRT7特異引物以及5’-RACE連接子內(nèi)外引物進(jìn)行巢式PCR，得到長(zhǎng)度為650bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，結(jié)果顯示SIRT7基因在人和鼠中存在單一的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)為C堿基，轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游沒有典型的TATAbox和GCbox，也沒有明顯的CpG島。
　　 3、克隆并鑒定SIRT7啟動(dòng)子區(qū)
　　 我們首次克隆并鑒定了SIRT7啟動(dòng)子區(qū)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明S

5、IRT7的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)到上游-2Kb的DNA片段具有啟動(dòng)子活性，并且這種啟動(dòng)子活性具有細(xì)胞特異性。通過啟動(dòng)子刪切實(shí)驗(yàn)表明，-312/-174的DNA片段為SIRT7啟動(dòng)子的關(guān)鍵區(qū)域。通過生物信息學(xué)的方法確定該區(qū)域含有保守的C/EBPa轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。
　　 4、Doxorubicin能夠影響SIRT7蛋白穩(wěn)定性，SIRT7蛋白穩(wěn)定性受泛素蛋白酶體途徑調(diào)控．
　　 我們發(fā)現(xiàn)在DNA損傷過程中，MCF7細(xì)胞內(nèi)SIRT7蛋白

6、水平快速下降。而SIRT7mRNA水平卻不下降。表明SIRT7蛋白調(diào)控過程發(fā)生于轉(zhuǎn)錄后水平。外源表達(dá)的SIRT7蛋白和內(nèi)源的SIRT7蛋白具有較短的半衰期，其穩(wěn)定性受泛素蛋白酶體的調(diào)控。體內(nèi)泛素化實(shí)驗(yàn)表明，SIRT7在細(xì)胞內(nèi)能夠發(fā)生多聚泛素化。
　　 5、SIRT7在細(xì)胞內(nèi)的亞細(xì)胞定位.
　　 免疫熒光顯示在HEK293T細(xì)胞和MCF7細(xì)胞和Huh7細(xì)胞中，外源表達(dá)的Flag-SIRT7并不定位于核仁，而是分布在細(xì)胞核內(nèi)

7、，并且在核膜內(nèi)側(cè)富集。在細(xì)胞分裂期，F(xiàn)lag-SIRT7不與染色體結(jié)合。而全長(zhǎng)的人源EGFP-SIRT7卻主要定位在核仁，在有絲分裂期，EGFP-SIRT7與染色體緊密結(jié)合。結(jié)果表明外源表達(dá)的SIRT7蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位依賴于表達(dá)量和融合標(biāo)簽類型。鑒于商業(yè)化SIRT7抗體特異性差，我們首次生產(chǎn)了識(shí)別小鼠SIRT7蛋白362-379位氨基酸的多克隆抗體，并證明了SIRT7多克隆抗體的特異性。使用SIRT7多克隆抗體，通過免疫熒光法，發(fā)現(xiàn)內(nèi)

8、源SIRT7在HEK293T,Huh7，MCF7細(xì)胞內(nèi)以點(diǎn)狀分布于細(xì)胞核，并且分布區(qū)域DAPI染色較淺。
　　 6、嘗試鑒定SIRT7的去乙?；傅幕钚?br>　　 我們純化原核表達(dá)的GST融合的SIRT7蛋白，在體外建立組蛋白去乙?；磻?yīng)體系。結(jié)果表明原核表達(dá)的SIRT7沒有組蛋白H4K16的去乙酰化的活性。用免疫熒光法發(fā)現(xiàn)在MCF7細(xì)胞內(nèi)，外源表達(dá)的SIRT7沒有H3K9Ac，H3K14Ac，H4K5AC，H4K8AC，H