端粒酶逆轉(zhuǎn)錄功能區(qū)基因的表達、純化和抗體制備.pdf

1、近來人端粒酶組分RNA和相關(guān)蛋白(TP1和hTRT)的分離、研究及其全基因的成功克隆,為圍繞端粒酶而進行的機制研究、端粒酶結(jié)構(gòu)研究、端粒酶抑制劑研究、及其與臨床診斷和治療的相關(guān)研究等等提供了可靠的基因材料[4、5、6、7].現(xiàn)已在體外證實端粒酶的RNA組分和TP1結(jié)合后表現(xiàn)出端粒酶活性,但其基因的表達與端粒酶的活性并不一致.體外重配實驗證實hTRT具有端粒酶活性,并發(fā)現(xiàn)hTRT水平與細胞端粒酶活性成正相關(guān).我們用基因工程的方法表達端粒酶

2、催化亞基.設(shè)計一對5'端有酶切位點ECoR和3'端為HindⅢ的引物,以pLPC-hTRT為模板可擴增出長為1310bp的基因片段,此片段包括端粒酶作為逆轉(zhuǎn)錄酶發(fā)揮逆轉(zhuǎn)錄功能所需的8個功能區(qū)(Tmotif"和7個小功能區(qū)(smallmotif)).將經(jīng)PCR擴增的片段克隆至帶有6個連續(xù)組氨酸的原核表達載體pET-28b,IPTG誘導(dǎo)表達后,用Western-blot檢測鑒定確定是否為目的蛋白.隨后分析目的蛋白的存在形式,是以分泌形式還是