端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶C端重組質(zhì)粒構(gòu)建與表達(dá)及對(duì)細(xì)胞增殖和活力的影響.pdf

1、研究背景和目的:
　　 端粒存在于真核生物線性染色體末端，其主要生物學(xué)功能是保護(hù)染色體末端，避免染色體末端被核酸酶降解，并有效防止染色體之間融合、重組和降解，在維持基因組的結(jié)構(gòu)完整性和穩(wěn)定性上起到重要作用。在正常人體細(xì)胞中，端?？呻S著細(xì)胞分裂而逐漸縮短，隨著分裂次數(shù)增加，分裂多次的細(xì)胞染色體端粒越來(lái)越短。當(dāng)縮短到一定程度時(shí)，染色體DNA將變得不再穩(wěn)定，細(xì)胞進(jìn)入增殖衰竭期，螺旋解開(kāi)，細(xì)胞繼續(xù)存活但不能再分裂，最終走向自然衰老或死亡

2、。
　　 人端粒酶是由人端粒酶RNA組分(hTR)，人端粒酶相關(guān)蛋白和人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)三部分組成的蛋白質(zhì)復(fù)合物。它能在缺少DNA模板的情況下，以自身RNA為模板通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄不斷合成新的端粒重復(fù)序列，并連接到染色體端粒3'末端，彌補(bǔ)端粒丟失，從而阻止端粒的縮短，并可能使得細(xì)胞最終逃脫程序性死亡，獲得無(wú)限增殖能力，即細(xì)胞永生化。在大部分的腫瘤組織中均檢測(cè)到端粒酶活性，端粒酶活性與惡性腫瘤有著密切關(guān)系。這表明端粒酶的激活可

3、能是腫瘤發(fā)生過(guò)程中的關(guān)鍵因素。90％以上的惡性腫瘤細(xì)胞因?yàn)榧せ疃肆Ｃ?，能把端?？s短的部分補(bǔ)上，細(xì)胞分裂后端粒并不縮短，這是腫瘤細(xì)胞永生化的重要前提條件，也使得端粒酶成為識(shí)別腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞的6個(gè)重要標(biāo)志之一。進(jìn)一步的研究表明.端粒酶的表達(dá)水平與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后有著高度相關(guān)性。
　　 人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)作為人端粒酶的重要組成部分之一。hTERTmRNA與端粒酶活性相一致，所以hTERT是控制細(xì)胞端粒酶

4、活性的限制酶之一，對(duì)維持腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)非常重要，抑制端粒酶活性可以使細(xì)胞內(nèi)的端粒正常地縮短長(zhǎng)度。
　　 hTERT對(duì)端粒的延伸作用，乃至腫瘤的發(fā)生過(guò)程，不僅僅是簡(jiǎn)單地激活端粒酶，而且還包括hTERT蛋白在胞漿和核仁之間的穿梭運(yùn)輸機(jī)制。研究中證實(shí)hTERTC-端第965-981氨基序列所編碼的蛋白是介導(dǎo)hTERT核仁定位的一個(gè)必須的核仁定位信號(hào)。進(jìn)一步研究中發(fā)現(xiàn)，第965-981氨基酸序列中富含保守的堿性氨基酸，該區(qū)域是決定hTE

5、RT核仁定位的關(guān)鍵信號(hào)。
　　 hTERT通過(guò)相關(guān)蛋白的作用與端粒DNA3'懸突端結(jié)合，使端粒引物末端剛好位于端粒酶RNA(TR)模板區(qū)的起始端，是使端粒不斷延伸的關(guān)鍵步驟。hTERT與端粒的結(jié)合部位主要是端粒DNA3'懸突端重復(fù)的(TTAGGG)n基因序列。有研究顯示hTERTC-端中的第963-972氨基酸序列、第993-1002氨基酸序列、第1047-1056氨基酸序列、第1077-1086氨基酸序列和第1108-1117

6、氨基酸序列所編碼的五個(gè)蛋白與端粒DNA3'懸突端重復(fù)序列存在蛋白結(jié)合活性，能夠與(TTAGGG)n重復(fù)序列形成蛋白質(zhì)-DNA結(jié)合物。
　　 本文擬在hTERTC-端截取編碼第936-1132氨基酸的堿基序列，并命名為hTERTC197，該基因序列包括核仁定位信號(hào)（第965-981氨基酸）和與端粒DNA3'懸突端結(jié)合的氨基酸序列（第963-972、993-1002、1047-1056、1077-1086、1108-1117氨基酸）

7、。將hTERTC197通過(guò)構(gòu)建原核重組質(zhì)粒和真核重組質(zhì)粒，并分別在原核表達(dá)系統(tǒng)和真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)該片段蛋白，為了探討hTERT在人類細(xì)胞內(nèi)的定位與結(jié)合的情況提供前期的研究基礎(chǔ)。
　　 為了初步研究hTERTC197對(duì)人類癌細(xì)胞和永生化細(xì)胞的作用，將構(gòu)建的真核重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染人子宮癌Hela細(xì)胞和永生化的人胚腎293T細(xì)胞，采用MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖和細(xì)胞活力。
　　 方法和內(nèi)容:
　　 1.hTERTC197原

8、核重組質(zhì)粒構(gòu)建與表達(dá)
　　 1.1外源基因片段的獲取
　　 通過(guò)引物設(shè)計(jì)軟件和原核表達(dá)載體多克隆位點(diǎn)區(qū)的特點(diǎn)設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物，引物兩端分別引入特異性酶切位點(diǎn)BamHI和XhoI，以hTERTcDNA為模板擴(kuò)增外源基因序列，并經(jīng)過(guò)回收純化得到外源基因片段。
　　 1.2重組質(zhì)粒的構(gòu)建
　　 原核表達(dá)載體pEGX-4T-1和外源基因片段通過(guò)特異性內(nèi)切酶BamHI和XhoI雙酶切，將得到的酶切產(chǎn)物通過(guò)T4連接

9、酶系統(tǒng)進(jìn)行連接反應(yīng)，所得連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α，構(gòu)建轉(zhuǎn)化菌。提取原核重組質(zhì)粒pEGX-4T-1-hTERTC197，并進(jìn)行一系列鑒定，確定原核重組質(zhì)粒的成功構(gòu)建。
　　 1.3目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)
　　 將成功構(gòu)建的原核重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入宿主菌BL21(DE3)，并進(jìn)行一系列鑒定確定工程菌的成功構(gòu)建。采用IPTG誘導(dǎo)工程菌表達(dá)目的蛋白，提取細(xì)菌蛋白后，通過(guò)蛋白電泳和免疫印跡法檢測(cè)和鑒定目的蛋白表達(dá)情況。
　　

10、2.hTERTC197真核組質(zhì)粒構(gòu)建與表達(dá)
　　 2.1外源基因片段的獲取
　　 通過(guò)引物設(shè)計(jì)軟件和原核表達(dá)載體多克隆位點(diǎn)區(qū)的特點(diǎn)設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物，引物兩端分別引入特異性酶切位點(diǎn)KpnI和XbaI，以hTERTcDNA為模板擴(kuò)增外源基因序列，并經(jīng)過(guò)回收純化得到外源基因片段。
　　 2.2重組質(zhì)粒的構(gòu)建
　　 真核表達(dá)載體pcDNA3.1-HisA和外源基因片段通過(guò)特異性內(nèi)切酶KpnI和XbaI雙酶切，將

11、得到的酶切產(chǎn)物通過(guò)T4連接酶系統(tǒng)進(jìn)行連接反應(yīng)，所得連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α，構(gòu)建轉(zhuǎn)化菌。提取真核重組質(zhì)粒pcDNA3.1-HisA-hTERTC197，并進(jìn)行一系列鑒定確定真核重組質(zhì)粒的成功構(gòu)建。
　　 2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染與蛋白表達(dá)
　　 采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將真核重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入人子宮癌Hela細(xì)胞和人胚腎293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后48小時(shí)提取各自細(xì)胞的細(xì)胞核蛋白。通過(guò)免疫印跡法鑒定目的蛋白的表達(dá)情況。
　　 3.hTE

12、RTC197對(duì)Hela和293T細(xì)胞的細(xì)胞增殖及細(xì)胞活力的影響
　　 3.1細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染
　　 按常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)方法對(duì)Hela細(xì)胞和293T細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇、傳代等操作。
　　 選擇96孔培養(yǎng)板接種細(xì)胞，將Hela細(xì)胞和293T細(xì)胞分別按1×104個(gè)/孔和1.1×104個(gè)/孔的細(xì)胞量各轉(zhuǎn)接于培養(yǎng)板。Hela細(xì)胞和293T細(xì)胞各轉(zhuǎn)接7塊96孔板，每塊培養(yǎng)板中鋪45個(gè)孔，待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)干預(yù)。
　　 3.2細(xì)

13、胞增殖及細(xì)胞活性影響的統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。
　　 實(shí)驗(yàn)干預(yù)后每隔24h取出Hela細(xì)胞和293T細(xì)胞各一塊培養(yǎng)板，MTT法測(cè)量所有實(shí)驗(yàn)孔OD值，空白組、空載體組和重組質(zhì)粒組各有3×5=15個(gè)單獨(dú)樣本。采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，使用析因分析法和單因素方差分析法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，分析是否具有顯著性差異。
　　 依照公式:抑制率(％)=（1-重組質(zhì)粒組OD值/空載體組OD值）×100％，計(jì)算每天的抑制率，從而得出hTERTC197對(duì)H

14、ela和293T細(xì)胞的細(xì)胞增殖及細(xì)胞活力的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1.外源基因片段可以通過(guò)PCR的方法擴(kuò)增。
　　 2.hTERTC197可以與原核載體pEGX-4T-1構(gòu)建原核重組質(zhì)粒。
　　 3.原核重組質(zhì)粒pEGX-4T-1-hTERTC197可以在宿主菌BL21中通過(guò)IPTG誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)，并通過(guò)免疫印跡法證明其表達(dá)。
　　 4.hTERTC197可以與真核載體pcDNA3.1-Hi

15、sA構(gòu)建真核重組質(zhì)粒。
　　 5.真核重組質(zhì)粒pcDNA3.1-HisA-hTERTC197可以通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞和293T細(xì)胞，并通過(guò)免疫印跡法證明，該蛋白能在細(xì)胞核內(nèi)被檢測(cè)。
　　 6.依照單因素方差分析結(jié)果顯示，在實(shí)驗(yàn)干預(yù)后七天內(nèi)，每天的空白組與空載體均無(wú)顯著性差異(P＞0.05);每天的空白組與重組質(zhì)粒組均有顯著性差異(P＜0.001);每天的空載體組與重組質(zhì)粒組均有顯著性差異(P＜0.001)。即轉(zhuǎn)染載

16、體pcDNA3.1-HisA對(duì)Hela細(xì)胞和293T細(xì)胞的增殖和活力無(wú)影響，而轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pcDNA3.1-HisA-hTERTC197對(duì)Hela細(xì)胞和293T細(xì)胞的增殖和活力有影響。
　　 7.通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析證明hTERTC197可以抑制Hela細(xì)胞和293T細(xì)胞的細(xì)胞增殖及細(xì)胞力性。hTERTC197對(duì)Hela細(xì)胞最大抑制出現(xiàn)在第五天，抑制率為33.07±0.229(％);hTERTC197對(duì)293T細(xì)胞最大抑制出現(xiàn)在第五天

17、，抑制率為33.92±0.114(％)。
　　 結(jié)論:
　　 1.成功構(gòu)建原核重組質(zhì)粒pEGX-4T-1-hTERTC197，并成功在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)融合蛋白。
　　 2.成功構(gòu)建真核重組質(zhì)粒pcDNA3.1-HisA-hTERTC197，并成功在真核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)融合蛋白。
　　 3.hTERTC197對(duì)Hela細(xì)胞和293T細(xì)胞的細(xì)胞增殖及細(xì)胞活力具有顯著性的抑制作用。
　　 本實(shí)驗(yàn)的創(chuàng)新之