以海藻酸三維支架構建MSC源性人工肝組織的實驗研究.pdf

1、目的:肝臟在人體內擔負著復雜的生理功能，對維持生命和內環(huán)境的穩(wěn)定起重要的作用。然而，急性肝衰竭、肝硬化等終未期肝病目前仍是醫(yī)學界難以解決的問題，死亡率非常高。我國是肝病大國，每年因肝病死亡者人數眾多。目前肝移植雖然是治療各種終末期肝病的有效方法，但是存在供體來源困難、手術復雜、患者需終生接受免疫抑制治療、費用昂貴等缺點，無法廣泛開展。肝組織工程的研究和進展給終末期肝病的治療帶來了新的希望。肝組織工程即把合適的種子細胞與生物支架材料相結合

2、，在一定的微環(huán)境下，經過誘導培養(yǎng)，形成一定量的肝實質細胞和組織，再移植到患者體內以修復或替代肝臟的功能；其最終目標是構建一個完整的、有功能的、可移植的肝臟。 肝組織工程研究的首要任務就是選擇可靠的并能提供足夠數量的種子細胞。胚胎干細胞由于倫理問題，其研究和應用受到一定限制；肝細胞株和肝干細胞因其具有成瘤傾向而不適宜體內移植；成熟肝細胞也有細胞獲取難度較大、異基因肝細胞可能產生免疫排斥反應、體外培養(yǎng)易失去活性與功能等諸多不足，不能

3、成為滿意的種子細胞。近年來，有關骨髓間質干細胞(bonemesenchymalstemcell，MSC)的研究給肝組織工程種子細胞帶來了新的選擇。 MSC是骨髓基質細胞的重要組成成分，不但與其他細胞一起支持造血干細胞造血，同時還表現出較強的可塑性，在不同的誘導條件下.能夠分化為多種組織細胞；同時MSC還具有分離培養(yǎng)容易、體外可大量擴增、遺傳背景相對穩(wěn)定、體內植入反應弱、易于接受外源基因的導入和表達等優(yōu)點。目前雖然已有眾多的研究證

4、明在體內MSC是肝臟修復過程中重要的肝外來源，在體外MSC也能在平面上被誘導分化為肝細胞，然而MSC要成為肝組織工程的種子細胞則必須與生物支架結合，并在立體結構上成肝誘導，這方面鮮有報導。因此研究MSC在三維立體支架上的成肝誘導方法，使MSC成為肝組織工程的種子細胞，同時將擴增的MSC及支架復合物在體外重塑形成具有一定功能的肝組織，或是進行體內移植以替代損傷的肝細胞，不僅具有非常重要的理論意義，也具有良好的臨床應用前景。 肝組織

5、工程的另一個研究內容即研發(fā)合適的支架材料。由于肝組織是代謝性軟組織，它對材料的力學性能要求與骨組織相比要低得多，而對細胞外基質蛋白的生物活性及微環(huán)境仿生要求更高。從這個意義上來講，諸如海藻酸、殼聚糖、膠原、纖維連接蛋白、層連蛋白、透明質酸等天然基質材料更適用于肝組織工程。海藻酸是從褐藻中提取的一種酸性多糖，由古洛糖醛酸與甘露糖醛酸組成的嵌段聚合物，可與二價金屬離子偶聯形成水凝膠。海藻酸支架具有良好的親水特性，疏松多孔的立體結構和優(yōu)越的組

6、織相容性，已經被作為細胞載體在組織工程研究包括肝組織工程上廣泛應用。 本研究擬通過構建海藻酸支架—MSC復合物，并在立體結構上誘導MSC向肝細胞分化來探討在體外構建MSC源性的人工肝組織的可能性；同時將其移植到肝功能不全大鼠體內來檢測此復合物是否能夠在肝功能不全大鼠體內能否實現肝臟功能的支持作用，為MSC和海藻酸支架在肝組織工程的進一步應用提供實驗基礎。 第一部分海藻酸支架—MSC復合物的構建及其生物相容性的研究

7、 一、材料與方法: 1.MSC的分離、培養(yǎng)、擴增及檢測 Wistar大鼠斷頸處死后無菌條件下取出股骨及脛骨，用含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液沖洗骨髓腔，離心后棄去上清并用DMEM重懸接種培養(yǎng)，按1:2傳代，傳至3～4代細胞備用。另取第3代MSC進行流式細胞儀檢測鑒定和誘導成骨鑒定。 2.海藻酸三維支架的構建 吸取3％的海藻酸鈉水溶液700μl滴入24孔塑料培養(yǎng)板的孔中，在孔內形成約1mm厚度的圓盤，再滴

8、入0.1％的CaCl22ml于圓盤上，靜置40min。待凝膠形成后棄去CaCl2，改用2mlα—2MEM浸泡，放入4℃冰箱，每24h更換α2MEM一次，72h后用于細胞培養(yǎng)。 3.MSC與海藻酸支架復合物的構建 將海藻酸三維立體支架放置于24孔板內，將含有1×106細胞的MSC懸液約200μl滴注于支架上并放置于培養(yǎng)箱內。 4.MSC與海藻酸支架復合物相容性的檢測 4.1普通顯微鏡觀察定期于倒置相差顯微鏡

9、下觀察MSC在支架上的黏附及增殖情況。 4.2掃描電鏡觀察細胞與支架復合物共同培養(yǎng)7天后于冰凍干燥箱內干燥24h，表面噴金后于Philps掃描電鏡下觀察。 4.3MTT實驗取第一代(P1)、P3、P5的MSC懸液，以1×104個/孔接種在放置于96孔培養(yǎng)板中的海藻酸三維立體培養(yǎng)支架上，加200μl細胞培養(yǎng)基，37℃恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)第1、3、5、7、9、11、13、15天，各代次分別隨機抽取3孔，進行MTT測定。

10、 4.4組織學檢測海藻酸支架和MSC復合物體外培養(yǎng)3天后4％多聚甲醛固定24h，常規(guī)酒精逐級脫水，石蠟包埋切片，行HE染色后觀察。 二、結論: 1.海藻酸三維支架具有適合作為細胞載體的特性和結構。 2.MSC與海藻酸三維支架具有良好的相容性，MSC在海藻酸三維支架上能良好地附著并生長。 第二部分利用海藻酸支架—MSC復合物體外構建人工肝組織的研究 一、材料與方法: 1.海藻酸支架—

11、MSC復合物的構建 2.誘導液的配置及誘導方法 60％DMEM，40％MCDB—201，1mg/ml牛血清蛋白(BSA)，10-8M地塞米松，10-4M維生素C，2％胎牛血清，10ng/mlEGF，20ng/mlHGF，10ng/mlFGF—4。將MSC按上述方法種植于支架并放置于24孔板內24h后加入誘導液，量約1ml/孔，每天換液，并于普通顯微鏡下觀察細胞情況。 3.被誘導的細胞表達肝細胞特異性功能的檢測

12、 3.1培養(yǎng)液尿素(UREA)、白蛋白(ALB)測定于誘導后的第7、14、21、28天將誘導液更換為不含胎牛血清的誘導液培養(yǎng)24h后吸取上清按照尿素氮檢測試劑盒和白蛋白液體試劑盒操作。 3.2RT—PCR法檢測被誘導細胞內肝細胞標志物的表達(AFP、ALB、Cox32、CYP7A1) 在誘導后的第14和28天時提取細胞總RNA，檢測甲AFP和ALB基因的表達情況，并于第28天檢測Cox32和CYP7A1的表達。

13、 3.3免疫熒光法檢測CK-18的表達誘導后的第28天取出支架與細胞復合物行冰凍切片，用羊抗鼠CK-18抗體和兔抗羊IgG(H+L)/TRITC孵育后于熒光顯微鏡下觀察。 3.4CK-18陽性率的檢測將完成CK-18染色的切片共10張，用Hoechst3328將切片上的所有細胞染核后檢測CK-18的陽性表達率。 3.5糖原染色檢測被誘導細胞糖原儲存功能另取部分切片，AAF液固定后PAS染色檢測支架上細胞糖原儲存功能。

14、 二、結論:以EGF、HGF、FGF—4等細胞因子混合液為誘導因子，能在海藻酸三維支架上成功誘導MSC向肝細胞分化；海藻酸三維支架和MSC在體外可望成為肝組織工程理想的種子細胞和細胞載體。 第三部分海藻酸支架—MSC復合物治療大鼠肝功能不全的研究 一、材料與方法: 1.MSC的培養(yǎng)、CM—DIL標記MSC的培養(yǎng)見第一部分。在MSC懸液內加入CM—DIL液約5μl，37℃孵育10min，4℃冰箱放置20min

15、，PBS洗3遍后待用。 2.MSC與海藻酸三維支架復合物的構建 3.實驗分組及處理實驗分獨立的70％肝切除大鼠組(A組)和肝硬化大鼠組(B組)，每組20只大鼠，雌雄各半。A、B兩組各細分實驗組(A1和B1)和對照組(A2和B2)。A1和B1組給予MSC—海藻酸支架復合物，A2和B2組則單獨給予海藻酸支架。 4.熒光顯微鏡下觀察標記了CM—DIL的MSC和支架細胞復合物將種植在24孔板內的支架細胞復合物放置于熒光顯

16、微鏡下在波長為540-650nm范圍內觀察。 5.冰凍切片觀察支架細胞復合物體內應用后情況手術后的第4周處死實驗組和對照組大鼠并取出支架細胞復合物，行冰凍切片并固定后置于熒光顯微鏡下觀察，并用Hoechst染核。 6.免疫組化法檢測復合物內白蛋白的表達取部分切片用羊抗鼠ALB溶液及驢抗羊液體孵化，DAB顯色法檢測。 二、結論： 　1.CM—Dil可以做為細胞體內示蹤的穩(wěn)定的染料。 　 2.在70％肝切除大鼠