sEng、TGFβ1與妊娠期高血壓疾病發(fā)生的相關(guān)性研究.pdf

1、妊娠期高血壓疾病(Hypertensive disorder complicating pregnancy，HDCP)是妊娠期特有疾病，病因和發(fā)病機制尚未完全闡明，已有研究表明，轉(zhuǎn)化生成因子TGFβ1及其受體與妊娠期高血壓疾病發(fā)生的中心環(huán)節(jié)-血管內(nèi)皮損傷及胎盤血管重鑄過程密切相關(guān)，本研究將通過觀察TGFβ1及其可溶性受體成份-sEng對體外培養(yǎng)的臍靜脈內(nèi)皮細胞及滋養(yǎng)細胞的影響，探討其在妊娠期高血壓疾病發(fā)生、發(fā)展中的作用。
　　第一

2、部分 sEng及TGFβ1與內(nèi)皮細胞損傷的相關(guān)性研究目的：觀察可溶性Endoglin(soluble endoglin，sEng)及轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGFβ1)對體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelialcell，HUVEC)增殖、凋亡的影響，及其對HUVEC產(chǎn)生一氧化氮(nitric oxide，NO)量，內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synt

3、hase，eNOS)1177位點絲氨酸磷酸化程度的影響，探討sEng及TGFβ1參與內(nèi)皮細胞損傷的可能機制。
　　方法：體外培養(yǎng)HUVEC，將3代以內(nèi)的HUVEC接種于96孔培養(yǎng)板，分4組：對照組(單純RPMI-1640完全培養(yǎng)液培養(yǎng))、sEng組、TGFβ1及(sEng+TGFβ1)組；根據(jù)四甲基偶氮唑藍(MTT)結(jié)果，將sEng組、TGFβ1及(sEng+TGFβ1)組按加藥濃度分別分為1、10、100μg/L三個亞組，收集6

4、h、12h，24h時間點的細胞及培養(yǎng)液。ELISA法測定細胞培養(yǎng)液中sEng及TGFβ1含量；MTT比色法檢測對照組、不同濃度sEng、TGFβ1及(sEng+TGFβ1)培養(yǎng)6h、12h、24h后HUVEC的細胞的存活率，流式細胞技術(shù)觀察各組凋亡率和細胞周期分布；硝酸酶還原法測定細胞培養(yǎng)液中NO含量，Western印跡法檢測各組細胞eNOS蛋白相對表達量及其1177位點絲氨酸磷酸化情況，實時熒光PCR檢測各組細胞eNOS mRNA的相

5、對表達量。
　　結(jié)果：(1)細胞培養(yǎng)液中sEng及TGFβ1的含量：24h、48h、72hHUVEC培養(yǎng)液中未測得sEng；24h、48h、72h細胞培養(yǎng)液中TGFβ1含量分別為(3.12±0.78)、(3.33±0.91)、(3.08±0.87)ng/L，三個時間段TGFβ1含量無明顯變化(F=2.10，p>0.05)。(2)細胞存活率：SEng組HUVEC存活率在各個濃度點及時間點均低于對照組和其它各組，且與時間和加藥濃度均呈

6、負相關(guān)；TGFβ1組，加1μg/L時HUVEC表現(xiàn)為增殖，存活率高于對照組，加10、100μg/L時，HUVEC存活率與時間和加藥濃度均呈負相關(guān)；(sEng+TGFβ1)組HUVEC存活率與對照組比較無顯著性差異，無時間及濃度依賴性。(3)細胞凋亡率和周期分布：sEng組，HUVEC凋亡率明顯增加，與加藥濃度及作用時間均呈正相關(guān)，sEng組G1期細胞比例顯著高于對照組，亦與濃度及時間呈正相關(guān)；TGFβ1各組HUVEC凋亡率與對照組各點比

7、較均無明顯差異，1μg/L組G1期細胞比例顯著低于對照組并與作用時間呈負相關(guān)，10、100μg/L組G1期細胞比例顯著高于對照組且與作用濃度及時間呈正相關(guān)；(sEng+TGFβ1)組HUVEC凋亡率、G1期細胞比例、存活率與對照組比較無顯著性差異，且無濃度及時間依賴性。(4)細胞培養(yǎng)液中NO含量變化：對照組培養(yǎng)液內(nèi)NO含量24 h內(nèi)無明顯變化(F=2.30，p>0.05)，sEng組細胞培養(yǎng)液中NO含量低于對照組和其它各組并與作用時間和

8、加藥濃度均呈負相關(guān)；TGFβ1組，加1μg/L時，細胞培養(yǎng)液中NO含量顯著高于對照組及其它各組，與作用時間呈正相關(guān)，加10、100μg/L時，細胞培養(yǎng)液中NO含量與時間和加藥濃度均呈負相關(guān)；(sEng+TGFβ1)組細胞培養(yǎng)液中NO含量與對照組比較無顯著性差異，亦無時間及濃度依賴性。(5)eNOS蛋白及mRNA表達水平變化：sEng組，HUVEC eNOS蛋白及mRNA表達在各個時間點及濃度點均低于對照組及其它各組，且與作用時間及加藥濃

9、度呈明顯的負相關(guān)；TGFIβ1組，加1μg/L時eNOS蛋白及mRNA表達水平在各個時間點均高于對照組及其它各組，且與時間呈正相關(guān)，加10、100gg/L時，eNOS蛋白及mRNA表達水平在各個濃度點及時間點均低于對照組但高于sEng組，且與作用時間及濃度呈負相關(guān)；(sEng+TGFβ1)組各個時間點及濃度點細胞eNOS蛋白及mRNA表達水平與對照組比較無顯著性差異。(6)eNOS蛋白活化情況：sEng組，eNOS-Ser(p)1177

10、/eNOS在各個時間點及濃度點均低于對照組及其它各組，并與作用時間及加藥濃度呈負相關(guān)；TGFβ1組，加1μg/L時eNOS-Ser(p)1177/eNOS在各個時間點均高于對照組及其它各組并與時間呈正相關(guān)，加10、100μg/L時，eNOS-Ser(p)1177/eNOS在各個濃度點及時間點均低于對照組但高于sEng組，且與時間及濃度呈負相關(guān)；(sEng+TGFβ1)組各個時間點及濃度點細胞eNOS-Ser(p)1177/eNOS與對照

11、組比較無顯著性差異。
　　結(jié)論：1、加入外源性sEng可與內(nèi)源性產(chǎn)生的TGFβ1結(jié)合阻斷TGFβ1的信號傳導(dǎo)，通過促進凋亡，并使細胞受阻于G1期，延緩其從G1期向S期過渡的方式，抑制HUVEC的增殖，同時通過下調(diào)eNOS1177位點絲氨酸的磷酸化水平，抑制eNOS的活性，使HUVEC分泌NO功能下降，進而影響內(nèi)皮細胞的舒縮功能。2、加入外源性的TGFβ1，對HUVEC的影響取決于作用濃度，高濃度TGFβ1主要通過使內(nèi)皮細胞受阻于G

12、1期，延緩其從G1期向S期過渡的方式，抑制HUVEC的增殖，同時通過下調(diào)eNOS1177位點絲氨酸的磷酸化水平，抑制eNOS的活性，使HUVEC分泌NO的能力下降，影響內(nèi)皮細胞的舒縮功能，低濃度的TGFβ1對HUVEC的作用與之相反。3、(sEng+TGFβ1)組HUVEC的增殖、eNOS活性、NO的產(chǎn)生與對照組比較無顯著差異，說明兩因子等量加入細胞培養(yǎng)液，sEng作為TGFβ1的受體，二者幾乎達到1:1結(jié)合，結(jié)合后二者均不能發(fā)揮前述作

13、用，推斷受體與配體成比例結(jié)合有助于內(nèi)皮細胞發(fā)揮正常的作用，任一因子過量使比例失調(diào)，則對HUVEC產(chǎn)生不同程度的影響，進而參與內(nèi)皮細胞功能的紊亂。
　　第二部分 sEng與TGFβ1對人早孕絨毛膜滋養(yǎng)細胞增殖及浸潤的影響目的：探討可溶性Endoglin與TGFβ1對人早孕絨毛膜滋養(yǎng)細胞增殖能力和浸潤功能的影響。
　　方法：采用胰蛋白酶-DNase消化法培養(yǎng)人早孕期(孕6～8周)絨毛膜滋養(yǎng)層細胞，將3代以內(nèi)的滋養(yǎng)細胞接種于96孔

14、培養(yǎng)板，分4組：對照組(單純DMEM完全培養(yǎng)液培養(yǎng))、sEng組、TGFβ1及(sEng+TGFβ1)組；ELISA法測定細胞培養(yǎng)液中sEng及TGFβ1含量；MTT法觀察滋養(yǎng)細胞的增殖情況并確定后續(xù)試驗中sEng、TGFβ1及(sEng+TGFβ1)的加藥濃度及作用時間；MTT法觀察各組細胞存活率，流式細胞技術(shù)觀察各組細胞的細胞周期變化，Transwell技術(shù)檢測各組滋養(yǎng)細胞的浸潤功能；Western印跡法檢測各組滋養(yǎng)細胞MMP-2、

15、MMP-9蛋白的表達；RT-PCR法檢測各組滋養(yǎng)細胞MMP-2、MMP-9mRNA的表達。
　　結(jié)論：sEng和TGFβ1可能通過調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細胞的G1期細胞比例，影響其增殖能力，但并不導(dǎo)致細胞的死亡；通過調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細胞MMP-2和MMP-9的表達影響其浸潤能力；在體外細胞培養(yǎng)環(huán)境下，sEng和TGFβ1可達到1:1的結(jié)合，并失去各自對滋養(yǎng)細胞的影響，據(jù)此推測，早孕期絨毛局部兩種因子比例失調(diào)，可能不同程度的影響滋養(yǎng)細胞向子宮肌層的正常浸