姜黃素對缺氧-復(fù)氧心肌細(xì)胞的保護(hù)作用及HSP70表達(dá)影響研究.pdf

1、目的：探討姜黃素對體外培養(yǎng)的缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞的保護(hù)和抗凋亡作用，明確其保護(hù)與濃度關(guān)系，以及姜黃素抗凋亡的機(jī)制與熱休克蛋白(HSP70)表達(dá)的關(guān)系，探討藥物誘導(dǎo)后HSP70表達(dá)的量效與時(shí)相的變化，明確藥物誘導(dǎo)后保護(hù)的時(shí)相及效果。
　　 方法：取出生1～3d的SD大鼠乳鼠的心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)，至同步搏動良好的原代培養(yǎng)細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)；用MTT法檢測姜黃素對心肌細(xì)胞的毒副作用，計(jì)算IC50，尋找對心肌細(xì)胞無明顯毒副作用的最佳干預(yù)濃度，并取

2、高、中、低濃度用于實(shí)驗(yàn)；細(xì)胞計(jì)數(shù)種板、實(shí)驗(yàn)分組和姜黃素干預(yù)后，應(yīng)用連續(xù)光譜多功能酶標(biāo)儀檢測各組、各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞上清液中乳酸脫氫酶(LDH)活性和丙二醛(MDA)含量；使用Hoechst33342和碘化丙啶(PI)雙染后熒光顯微鏡照相的方法觀測細(xì)胞凋亡與壞死；免疫組織化學(xué)方法觀察各組心肌細(xì)胞中.HSP70表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：
　　 1.姜黃素作用于正常心肌細(xì)胞時(shí)IC50為77.57μmol/L，本實(shí)驗(yàn)分組中選取的姜黃素高

3、、中、低濃度組分別為50μmol/L、25μmol/L、12.5μmol/L。
　　 2.各組細(xì)胞培養(yǎng)液中的LDH活性的比較對相同時(shí)間點(diǎn)各組細(xì)胞比較，發(fā)現(xiàn)正常對照組LDH活性最低；LDH活性隨姜黃素濃度降低而活性升高；各組細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)比較，發(fā)現(xiàn)正常對照組細(xì)胞隨時(shí)間改變，LDH活性改變無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.292)，經(jīng)過缺氧/復(fù)氧損傷的心肌細(xì)胞隨時(shí)間延長，LDH活性增加，并且各組細(xì)胞LDH活性隨時(shí)間延長呈先遞增后遞減趨勢，于12

4、h達(dá)高峰，24h時(shí)有所降低。
　　 3.各組細(xì)胞培養(yǎng)液中的MDA含量的比較對相同時(shí)間點(diǎn)各組細(xì)胞比較，發(fā)現(xiàn)正常對照組MDA含量最低；MDA含量隨姜黃素濃度降低而活性升高；各組細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)比較，發(fā)現(xiàn)正常對照組細(xì)胞隨時(shí)間改變，MDA含量改變無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.122)，經(jīng)過缺氧/復(fù)氧損傷的心肌細(xì)胞隨時(shí)間延長，MDA含量有增加不同，并且各組MDA含量隨時(shí)間延長呈遞增趨勢，于24h最高。
　　 4.各組細(xì)胞的凋亡與壞死比較相同

5、時(shí)間點(diǎn)各組細(xì)胞比較：缺氧/復(fù)氧0h，細(xì)胞凋亡不多，各組中未見明顯的凋亡細(xì)胞。缺氧/復(fù)氧2h、4h、12h、24h各處理組細(xì)胞，與正常對照組相比，可見細(xì)胞凋亡增多，但給予姜黃素干預(yù)組細(xì)胞較FR組細(xì)胞凋亡少，并且細(xì)胞凋亡與姜黃素濃度成反比。不同時(shí)間點(diǎn)比較：正常對照組細(xì)胞隨時(shí)間改變，細(xì)胞凋亡不明顯；而經(jīng)過缺氧/復(fù)氧損傷的心肌細(xì)胞隨時(shí)間延長，凋亡呈遞增趨勢；給予姜黃素干預(yù)組細(xì)胞較I/R組細(xì)胞凋亡少，并且細(xì)胞凋亡與姜黃素濃度成反比。
　　

6、 5.免疫組織化學(xué)檢測各組細(xì)胞中HSP70變化相同時(shí)間點(diǎn)各組細(xì)胞比較：缺氧/復(fù)氧Oh，細(xì)胞中HSP70表達(dá)較少，幾乎不表達(dá)。缺氧/復(fù)氧2h、4h、12h、24h各處理組細(xì)胞，與正常對照組相比，可見細(xì)胞中HSP70增多，但給予姜黃素干預(yù)組細(xì)胞較I/R組細(xì)胞表達(dá)增多，并且細(xì)胞中HSP70表達(dá)量與姜黃素濃度成正比。不同時(shí)間點(diǎn)比較：正常對照組細(xì)胞中HSP70幾乎不表達(dá)，隨時(shí)間改變，無明顯變化；而經(jīng)過缺氧/復(fù)氧損傷的心肌細(xì)胞隨時(shí)間延長，細(xì)胞中HS

7、P70表達(dá)增加。給予姜黃素干預(yù)組細(xì)胞較I/R組細(xì)胞HSP70表達(dá)量增多，并且細(xì)胞中HSP70表達(dá)量與姜黃素濃度成正比。
　　 結(jié)論：
　　 1.姜黃素對體外培養(yǎng)的缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞具有保護(hù)和抗凋亡作用，其保護(hù)作用與姜黃素濃度呈現(xiàn)一定的劑量依賴關(guān)系。
　　 2.隨姜黃素濃度增加，缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞。HSP70表達(dá)增加，并且缺氧/復(fù)氧損傷心肌細(xì)胞隨時(shí)間延長，細(xì)胞內(nèi)HSP70表達(dá)增加。姜黃素對缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞保護(hù)作用