酸敏感離子通道1a在肝纖維化星狀細胞中的表達、作用及機制研究.pdf

1、酸敏感離子通道（acid-sensing ion channels，ASICs）是一類由胞外酸激活的陽離子通道，開放的通道對Na+、Ca2+有通透性，進而引起細胞一系列生理病理變化。目前為止，已發(fā)現(xiàn)4個基因編碼的7個ASICs亞基（ASIC1a、ASIClb、ASIClb2、ASIC2a、ASIC2b、ASIC3、ASIC4），均屬于DEG/ENaC家族成員。近年來ASICs研究備受關(guān)注，其不僅在神經(jīng)系統(tǒng)中存在表達并發(fā)揮疼痛、感覺、神經(jīng)

2、傳遞等調(diào)節(jié)作用，還在非神經(jīng)系統(tǒng)如腫瘤、炎癥、缺血性損傷、胃腸道疾病中發(fā)揮作用，這些病理反應中共同的特點是局部組織環(huán)境酸化、pH值下降，誘發(fā)ASICs激活導致Na+、Ca2+內(nèi)流，進而引起各種病理生理效應。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)SD大鼠關(guān)節(jié)軟骨中存在ASIC1a、ASIC2a和ASIC3的表達，在佐劑性關(guān)節(jié)炎(Adjuvant Arthritis, AA)大鼠關(guān)節(jié)軟骨中ASIC1a、ASIC2a和ASIC3的表達均明顯高于正常組，ASICs

3、非特異性阻滯劑Amiloride、非甾體類抗炎藥阿司匹林能明顯抑制ASICs表達，并對AA大鼠關(guān)節(jié)軟骨具有保護作用。進一步考察ASICs在關(guān)節(jié)炎中作用機制發(fā)現(xiàn)，當大鼠關(guān)節(jié)炎癥發(fā)生時，可造成局部關(guān)節(jié)酸化，ASICs表達增加和通道開放，Ca2+流入關(guān)節(jié)軟骨細胞內(nèi)，導致關(guān)節(jié)軟骨細胞外基質(zhì)（Extracellular matrix，ECM）代謝失衡引起關(guān)節(jié)軟骨損傷。
　　肝纖維化（hepatic fibrosis，HF）是慢性肝病的共同病

4、理過程，是形成肝硬化的中間階段。目前研究認為，病毒感染和酒精的過量攝入導致肝臟炎癥是肝纖維化形成的主因。當炎癥刺激時，肝臟產(chǎn)生氧化應激和脂質(zhì)過氧化損傷，酸性代謝產(chǎn)物增加，肝星狀細胞（Hepatic stellate cells，HSCs）活化增殖，轉(zhuǎn)化為肌樣成纖維細胞，表達α-SMA，合成和分泌細胞外基質(zhì)（extracellular matrix， ECM）增加，導致ECM的合成與降解失衡，致使過多的ECM在肝組織沉積形成纖維化。該病理

5、進程與關(guān)節(jié)炎癥類似，即同樣存在炎癥導致的局部酸化，同樣引起ECM代謝的失衡，那么，肝臟是否存在ASICs的表達？當肝纖維化時肝組織的酸性代謝會否導致ASICs的表達增加和通道激活，進而發(fā)揮其病理生理學作用？為此，我們研究以下內(nèi)容：
　　1.ASIC1a在大鼠肝組織、肝星狀細胞的表達
　　分離大鼠肝組織， RT-PCR檢測ASIC1a mRNA表達，發(fā)現(xiàn)大鼠肝組織中存在ASIC1a的表達，CCl4誘導的肝纖維化模型大鼠ASIC

6、1a mRNA表達增加；采用ASIC1a、α-SMA免疫熒光雙標染色模型組大鼠肝組織，發(fā)現(xiàn)大鼠肝組織ASIC1a與α-SMA染色區(qū)域高度重疊，提示ASIC1a主要表達與活化肝星狀細胞。肝灌注分離正常組、模型組大鼠HSC細胞進行RT-PCR，Western blot發(fā)現(xiàn)，正常組HSCs存在ASIC1a mRNA及其蛋白表達，模型組表達高于正常組。選擇HSC-T6表型活化細胞株，用酸誘導HSC-T6體外模型（pH6.0），考察不同pH值環(huán)境

7、下ASIC1a在HSC-T6的動態(tài)表達，研究發(fā)現(xiàn)，與pH7.4組相比，pH6.0酸誘導HSC-T6組ASIC1a表達增加。
　　2. ASIC1a阻滯劑Amiloride對CCl4誘導大鼠肝纖維化的保護作用
　　建立CCl4實驗性肝纖維化大鼠模型，灌胃給予不同劑量ASIC1a阻滯劑阿米洛利（Amiloride，10，5，2.5mg/kg），觀察Amiloride對大鼠肝纖維化的影響，驗證ASIC1a在肝纖維化進程中的作用。結(jié)

8、果發(fā)現(xiàn)，Amiloride能顯著抑制肝纖維化大鼠肝、脾指數(shù)增加；降低血清中升高的ALT、AST、HA、LN、PCⅢ、CⅣ；病理組織學顯示Amiloride組肝臟組織結(jié)構(gòu)明顯改善，肝纖維化增生程度減輕，提示Amiloride對CCl4所致大鼠肝纖維化有明顯的保護作用。進一步研究發(fā)現(xiàn)，Amiloride可以顯著抑制肝組織中ASIC1a的表達，降低肝纖維化大鼠血清中IL-1、IL-6的等炎性因子的含量；抑制肝組織中α-SMA、TGF-β1、N

9、FκB和Collagen I的蛋白表達。研究提示，ASIC1a參與肝纖維化疾病進程，Amiloride對實驗性肝纖維化的保護作用可能與其抑制ASIC1a，進而調(diào)節(jié)HSCs功能有關(guān)。
　　3. ASIC1a對酸誘導HSC-T6細胞內(nèi)Ca2+濃度、細胞增殖和基質(zhì)代謝的影響
　　建立酸誘導HSC-T6體外模型，采用Amiloride、ASIC1a特異性阻滯劑PcTX1干預，考察抑制ASIC1a對HSC-T6細胞胞內(nèi)Ca2+濃度、細

10、胞增殖及基質(zhì)代謝的影響。激光共聚焦顯微鏡、Ca2+成像研究HSC-T6胞內(nèi)Ca2+的變化發(fā)現(xiàn)，pH6.0能明顯促進Ca2+流入HSC-T6胞內(nèi)，Amiloride、PcTX1干預后，Ca2+內(nèi)流明顯減少；MTT法觀察ASIC1a阻滯劑對酸誘導 HSC-T6的細胞增殖的影響，與pH6.0組相比， Amiloride（200、100、50μM）、PcTX1干預后，HSC-T6細胞生長明顯被抑制，且呈劑量效應關(guān)系；研究HSC-T6功能的影響，

11、發(fā)現(xiàn)與pH7.4組相比，酸處理至pH6.0 HSC-T6細胞中α-SMA、TGF-β1、collagen I表達增加，Amiloride、PcTX1干預后α-SMA、TGF-β1、collagen I表達降低。進一步觀察發(fā)現(xiàn)，pH6.0 HSC-T6細胞中MMP-13明顯降低， TIMP-1明顯上調(diào)，Amiloride、PcTX1能抑制酸性環(huán)境下TIMP-1的增加，升高被降低的MMP-13含量，MMP-9、TIMP-2在酸誘導HSC-T

12、6含量變化不明顯。研究提示， ASIC1a參與HSCs功能和代謝過程，當酸刺激下，ASIC1a激活和通道開放，使HSC-T6細胞Ca2+內(nèi)流增加，進而調(diào)節(jié)HSC-T6細胞生長和膠原分泌，其調(diào)節(jié)膠原代謝的過程還與MMP-13、TIMP-1的變化有關(guān)。
　　4. MAPK信號通路在ASIC1a調(diào)節(jié)HSC功能中的作用
　　建立酸誘導HSC-T6體外模型，采用ASIC1a非特異性阻滯劑Amiloride、ASIC1a特異性阻滯劑Pc

13、TX1、p38 MAPK阻斷劑SB203580、ERK1/2阻斷劑PD98059干預，考察MAPK信號通路在ASIC1a調(diào)節(jié)HSC功能中的作用。研究結(jié)果顯示，ASIC1a激活可影響大鼠HSC-T6細胞磷酸化p38 MAPK和磷酸化ERK1/2蛋白表達；Amiloride、PcTX1、p38 MAPK阻斷劑 SB203580、ERK1/2阻斷劑 PD98059不同程度抑制 p38 MAPK和磷酸化 ERK1/2蛋白表達；進一步研究發(fā)現(xiàn)，p

14、38 MAPK阻斷劑、ERK1/2阻斷劑不影響酸誘導HSC-T6細胞中Ca2+的流入，但p38 MAPK阻斷劑、ERK1/2阻斷劑均能降低collagen I mRNA的表達，其調(diào)控機制與p38 MAPK調(diào)控MMP-13、ERK調(diào)控TIMP-1的表達水平有關(guān)。結(jié)果提示胞外酸化激活ASIC1a通過激活Ca2+依賴的ERK調(diào)控TIMP-1的代謝和Ca2+依賴的p38 MAPK調(diào)控MMP-13的代謝發(fā)揮HSC-T6膠原代謝的調(diào)節(jié)作用。