酸敏感離子通道2a在腦缺血和脊髓損傷中的作用機(jī)制的研究.pdf

1、隨著我國經(jīng)濟(jì)水平的提高、人們生活習(xí)慣的改變和交通情況的惡化，諸如腦缺血、脊髓損傷等神經(jīng)系統(tǒng)的損傷越來越多。而此類的神經(jīng)系統(tǒng)損傷不僅給個(gè)人的生活質(zhì)量帶來極大的損害，同時(shí)也給家庭和社會帶來了巨大的負(fù)擔(dān)。然而，目前對于腦缺血和脊髓損傷，臨床上并沒有有效的藥物及方法治愈。據(jù)研究者報(bào)道，在腦缺血和脊髓損傷后，均會由于炎癥和酸性產(chǎn)物堆積等原因引起局部環(huán)境酸化。隨著局部環(huán)境的酸化，酸敏感離子通道（Acid Sensing Ion Channel，AS

2、IC）就會被大量激活。ASIC通道家族有7個(gè)亞基，分別為1a、1b1、1b2、2a、2b、3和4。現(xiàn)在已經(jīng)有大量研究表明ASIC1a在神經(jīng)系統(tǒng)損傷中起著加速神經(jīng)元死亡的作用，我們科室研究也發(fā)現(xiàn)ASIC1a介導(dǎo)了脊髓損傷后神經(jīng)元的繼發(fā)損傷。而ASIC2a的作用至今還沒有明確的研究表明其在腦缺血及脊髓損傷中起著什么樣的作用。所以，本研究旨在研究ASIC2a在腦缺血及脊髓損傷后的作用及機(jī)制。
　　目的：
　　1.觀察ASIC2a在

3、腦缺血后表達(dá)變化規(guī)律及其在腦缺血中的作用。
　　2.觀察ASIC2a在脊髓損傷后表達(dá)變化規(guī)律及其在脊髓損傷中的作用。
　　3.探討ASIC2a可能的作用機(jī)制。
　　方法：
　　1.采用大鼠大腦中動脈閉塞模型和脊髓損傷模型,應(yīng)用組織病理學(xué)及TTC染色等方法,觀察MCAO及SCI后組織病理變化過程。
　　2.應(yīng)用westernblotting觀察MCAO及SCI后ASIC2a表達(dá)變化規(guī)律及其變化意義。
　

4、　3.應(yīng)用病毒轉(zhuǎn)染調(diào)節(jié) ASIC2a的表達(dá)，然后通過 MTT染色、行為學(xué)評分、誘發(fā)電位等技術(shù)探討ASIC2a在MCAO及SCI繼發(fā)損傷中的作用及其機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　1.大鼠大腦中動脈閉塞后，腦組織出現(xiàn)水腫，并在24小時(shí)以內(nèi)，水腫面積不斷擴(kuò)大，腦組織細(xì)胞核固縮、細(xì)胞皺縮。大鼠則出現(xiàn)病灶對側(cè)前爪屈曲、行走時(shí)轉(zhuǎn)圈、向癱瘓側(cè)摔倒并最終意識喪失及死亡，其中24小時(shí)死亡率高達(dá)45％。應(yīng)用western blotting的方法檢測發(fā)

5、現(xiàn)ASIC2a水平在大腦中動脈閉塞及脊髓損傷后呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢。其中在大腦中動脈閉塞后，ASIC2a表現(xiàn)為持續(xù)升高，但是在損傷12小時(shí)后才出現(xiàn)明顯的升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p<0.05）。病毒轉(zhuǎn)染后ASIC2a水平受到明顯調(diào)節(jié)。ASIC2a下調(diào)后，組織水腫明顯加重，HE染色提示組織損傷加重，細(xì)胞核固縮，細(xì)胞核數(shù)目減少。應(yīng)用TTC染色檢測方法發(fā)現(xiàn)大鼠在大腦中動脈閉塞后，腦組織缺血面積在24小時(shí)內(nèi)逐漸增大，在24小時(shí)達(dá)到最大。但是在下調(diào)A

6、SIC2a表達(dá)后，缺血面積明顯增大，其梗死率在12小時(shí)即達(dá)到37.4%，相對于MCAO組及空病毒組明顯擴(kuò)大。應(yīng)用改良bederson評分評估大鼠MCAO后神經(jīng)損傷情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MCAO后12小時(shí)，評分為ASIC2a下調(diào)組3.2、MCAO組2.3和空病毒組2.4，ASIC2a下調(diào)后神經(jīng)功能明顯下降。
　　2.Allen’s脊髓損傷模型參數(shù)為10g重物10mm下落砸擊，砸擊面積為2mm，砸擊后損傷處周圍即出現(xiàn)明顯水腫，大鼠后肢即完全

7、喪失運(yùn)動能力，并有尿儲留。在損傷后28天內(nèi)，后肢運(yùn)動能力呈現(xiàn)出逐漸恢復(fù)的趨勢，且趨勢較為穩(wěn)定。應(yīng)用western blotting的方法檢測發(fā)現(xiàn)在脊髓損傷后，損傷中心0.5cm范圍的脊髓組織內(nèi)ASIC2a水平在3h后下降，然而，在損傷的頭端和尾端0.5cm內(nèi)ASIC2a則在3h后開始升高。ASIC2a改變有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。病毒轉(zhuǎn)染后ASIC2a水平受到明顯調(diào)節(jié)。ASIC2a上調(diào)后，組織損傷情況減輕，存活細(xì)胞數(shù)目增多，細(xì)胞水腫

8、減輕。ASIC2a下調(diào)后，則損傷加重。體外實(shí)驗(yàn)表明在神經(jīng)元氧糖剝奪模型建立后，神經(jīng)元數(shù)目明顯下降，軸突明顯縮短，同時(shí)細(xì)胞間連接也減少。而ASIC2a下調(diào)加重了氧糖剝奪給神經(jīng)元帶來的損害，上調(diào)ASIC2a則保護(hù)神經(jīng)元減少受到氧糖剝奪的影響。MTT檢測在神經(jīng)元氧糖剝奪模型建立24小時(shí)后完成。實(shí)驗(yàn)表明氧糖剝奪模型減少了神經(jīng)元活性，但是上調(diào)ASIC2a可以減輕這種效果，而下調(diào)ASIC2a則加重了氧糖剝奪對神經(jīng)元的損傷。經(jīng)SEP檢測，正常大鼠體感

9、誘發(fā)電位潛伏期為5.5ms,在脊髓損傷后7天潛伏期延長至21ms。但是在上調(diào)ASIC2a表達(dá)后，脊髓損傷的大鼠SEP潛伏期縮短至15.3ms，而下調(diào)ASIC2a表達(dá)后，潛伏期延長至25.6ms。大鼠脊髓損傷后28天內(nèi)BBB評分，從記錄結(jié)果中可以發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組無任何后肢運(yùn)動功能障礙，28天內(nèi)評分均為21分；脊髓損傷+空病毒（對照組）大鼠在傷后第3天出現(xiàn)后肢功能恢復(fù)，評分為1分，在第3天到第7天恢復(fù)速度較快，隨后又趨于平緩，在傷后第28天評

10、分可達(dá)到10.0±0.2分。而轉(zhuǎn)染了ASIC2a干擾慢病毒的大鼠后肢運(yùn)動功能恢復(fù)能力較差，傷后第3天仍然無可見的后肢運(yùn)動，評分為0分，隨后后肢運(yùn)動功能緩慢恢復(fù)，到第28天時(shí)評分為5.8±0.1分；轉(zhuǎn)染了ASIC2a過表達(dá)慢病毒的大鼠后肢恢復(fù)情況相對較好，傷后第三天即可恢復(fù)至2.6分，在隨后到28天內(nèi)，均有較多的恢復(fù)，第28天時(shí)評分可達(dá)到12.6±0.2分。
　　3.ASIC2a可以增加神經(jīng)元對缺氧缺糖的耐受，減少神經(jīng)系統(tǒng)酸中毒時(shí)的

11、鈣離子內(nèi)流。
　　結(jié)論：
　　1.ASIC2a下調(diào)后MCAO后腦梗塞面積明顯增加，動物也表現(xiàn)出更多的偏癱癥狀。下調(diào)ASIC2a后，動物在SCI后明顯表現(xiàn)出更糟糕的運(yùn)動障礙和感覺障礙，脊髓組織損傷加重，神經(jīng)元對缺氧的耐受也變差。反之上調(diào)ASIC2a則可以緩解這一系列癥狀，神經(jīng)元對缺氧也更加耐受。
　　2.ASIC2a可能為一個(gè)內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)因子，在腦缺血和脊髓損傷后都有一定的神經(jīng)保護(hù)作用。有可能成為以后臨床上治療腦缺血和