轉(zhuǎn)錄因子Goosecoid在肝纖維化中的表達及作用.pdf

1、肝纖維化（liver fibrosis）是一系列損傷因子作用后引起的一種可逆性性損傷后修復(fù)的過程，其主要特征是細胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)的過度沉積。在當今社會，是一個預(yù)后極差且病死率很高的疾病，嚴重威脅著人類的健康。當肝臟受到致病因子刺激時，靜止狀態(tài)的HSC被激活轉(zhuǎn)化為肌成纖維樣細胞，細胞增殖加快，膠原大量沉積。因此研究 HSC增殖、凋亡以及遷移機制對研究肝纖維化具有重要意義。
　　上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)

2、化(epithelial epithelial-mesenchymal transition, EMT)是指細胞由上皮表型轉(zhuǎn)化成為間質(zhì)表型。研究表明EMT與胚胎發(fā)育、纖維化、器官再生以及腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)。EMT參與了靜息HSC轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞表型HSC的過程。
　　Goosecoid(GSC)屬于同源異型框(homeobox)轉(zhuǎn)錄因子，在原腸胚形成、耳泡的發(fā)育、乳腺癌細胞發(fā)生中，GSC作為組織者基因之一，均可誘導(dǎo)EMT，促進細胞的遷

3、移。目前，GSC已成為公認的誘導(dǎo)EMT的轉(zhuǎn)錄因子，用于EMT的研究。GSC可誘導(dǎo)胚胎發(fā)育及腫瘤進展相關(guān)的EMT，而其在器官纖維化相關(guān)EMT中的作用尚無報道。TGF-β是促進肝纖維化的關(guān)鍵因素。在胚胎發(fā)育及腫瘤進展中，TGF-β均可上調(diào)GSC的表達，但GSC在肝纖維化中的作用尚不明確。
　　目的：明確GSC在肝纖維化及HSC活化中的表達情況，研究GSC對HSC活化、增殖、凋亡及遷移的影響。為肝纖維化的治療提供新靶點。
　　方法

4、：本實驗通過腹腔注射CCl4建立小鼠肝纖維化模型作為模型組,腹腔注射Oil作為對照組，在體內(nèi)觀察肝纖維化中GSC的變化，通過HE染色觀察肝臟大體形態(tài)，Masson染色觀察膠原變化，通過免疫組化法研究小鼠肝臟中α-SMA、Collagen I及GSC的表達。并用TGF-β刺激LX-2細胞活化，在體外觀察HSC活化后GSC的變化，在體外用小干擾RNA敲低HSC中GSC，用Westen blot分析、Real-time PCR方法觀察GSC和

5、HSC活化指標α-SMA及Collagen I的表達變化，用CCK-8及BrDu摻入實驗研究敲低GSC對HSC增殖的影響；用Annexin V/PI雙染檢測細胞凋亡情況，并進一步應(yīng)用Western Blot檢測凋亡相關(guān)蛋白caspase-3和PARP的活性及表達，用劃痕實驗研究敲低GSC對HSC遷移的影響。
　　結(jié)果：
　　1小鼠肝纖維化形成過程中GSC表達量升高
　　HE結(jié)果顯示對照組：肝臟組織結(jié)構(gòu)正常，肝細胞沿中心

6、靜脈呈放射狀排列，排列整齊，肝細胞大小、形態(tài)規(guī)則，無脂肪變性以及炎細胞浸潤；模型組中正常肝小葉結(jié)構(gòu)消失，肝細胞排列紊亂，少量炎細胞浸潤。Masson染色結(jié)果顯示模型組纖維結(jié)締組織明顯增多。IHC結(jié)果顯示，較對照組，模型組肝纖維化指標α-SMA、Collagen I表達量增多,GSC表達量明顯高于對照組，以上結(jié)果表明CCl4腹腔注射可誘導(dǎo)明顯的肝纖維化，并且在此過程中GSC表達量升高。
　　2體外應(yīng)用TGF-β誘導(dǎo)HSC活化可上調(diào)G

7、SC表達
　　Western Blot分析結(jié)果顯示，用TGF-β干預(yù)人HSC細胞系LX-2后， HSC活化指標α-SMA及Collagen I的蛋白表達量較Control組顯著升高；同時GSC的蛋白表達量顯著升高。Real-time PCR結(jié)果顯示，與Control組相比， TGF-β干預(yù)組的HSC活化指標α-SMA及Collagen I的mRNA水平明顯升高；并且GSC的mRNA水平顯著升高。以上結(jié)果表明，GSC與HSC活化可能

8、具有正相關(guān)關(guān)系。
　　3體外應(yīng)用siRNA敲低GSC可抑制HSC活化
　　Real-time PCR結(jié)果表明，siGSC轉(zhuǎn)染48 h后，GSC的mRNA水平明顯下降，轉(zhuǎn)染72 h后進一步下降，表明GSC被有效敲低。與轉(zhuǎn)染siControl組相比，用siRNA敲低GSC后，HSC活化指標α-SMA及Collagen I mRNA水平顯著降低。Western Blot分析結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染siControl組相比，轉(zhuǎn)染siGSC后

9、，HSC活化指標α-SMA及Collagen I的蛋白表達量顯著降低。表明GSC可促進HSC活化。
　　4敲低GSC抑制HSC增殖
　　用siGSC轉(zhuǎn)染LX-2，CCK-8試驗檢測細胞活力，結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染siControl組相比，轉(zhuǎn)染siGSC72 h后，OD450值明顯降低。用BrdU摻入實驗檢測細胞DNA合成情況，評估細胞增殖情況。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染siGSC后， DNA合成明顯減少。提示GSC可促進LX-2增殖。

10、　　5敲低GSC不影響HSC凋亡
　　Western Blot分析結(jié)果顯示，與siControl組相比，轉(zhuǎn)染siGSC后，凋亡相關(guān)蛋白caspase-3的活性及PARP的表達無顯著變化；用Annexin V/PI雙染檢測細胞凋亡。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染siControl組與轉(zhuǎn)染siGSC組的凋亡細胞百分比無統(tǒng)計學(xué)差異。表明GSC不影響HSC凋亡。
　　6敲低GSC抑制HSC遷移功能
　　細胞創(chuàng)傷愈合實驗結(jié)果顯示，在LX-2中，轉(zhuǎn)