日本血吸蟲感染小鼠肝腸組織中AKP、鈣化物以及PDI和ATPase的表達研究.pdf

1、目的：
　　 1.采用堿性磷酸酶(AKP)與鈣化物染色方法，檢測二者在日本血吸蟲(Sj)感染小鼠吡喹酮常規(guī)治療前后不同時間點肝臟、結(jié)腸組織蟲卵的陽性水平，以期作為判別組織中蟲卵死與活的標志物，為臨床血吸蟲病療效考察提供實驗依據(jù)。
　　 2.通過檢測Sj感染小鼠治療前后肝臟、結(jié)腸組織中PDI和ATPase的表達水平，觀察不同分期肝臟、結(jié)腸組織病理損害程度，以期為評估血吸蟲病預(yù)后提供有效指標。
　　 方法：
　

2、　 1.建立Sj感染后和治療后不同時間點的小鼠模型，取63只健康清潔級昆明小鼠，除正常對照組(N)9只外，其他按常規(guī)經(jīng)腹部皮膚感染Sj尾蚴，感染后第45d隨機分為6組:感染后45d、90d、120d三個不同時點各1組（即I45d、I90d、I120d）和在感染后第45d用吡喹酮300mg/kg.d×2次治療后1M、2M和3M三個不同時點各1組（即T1M、T2M和T3M組）。各模型鼠在解剖時均做灌注沖蟲，查獲腸系膜靜脈內(nèi)蟲體存活情況。取

3、各組小鼠肝臟與結(jié)腸黏膜，作冰凍切片和石蠟包埋切片。
　　 2.用偶氮偶聯(lián)法和NBT/BCIP兩種AKP染色方法及VON KOSSA染色法對肝腸組織切片中蟲卵進行比較觀察，計數(shù)顯色和不顯色的蟲卵數(shù)，依據(jù)蟲卵顯色陽性率，比較分析三種染色法對血吸蟲死卵和活卵鑒定的效果。
　　 3.用常規(guī)HE和Masson染色法比較觀察各組小鼠肝腸組織病變差異;用免疫組化法檢測各組小鼠肝和結(jié)腸病變組織中PDI與ATPase表達水平，比較分析其在

4、肝與腸二者間的相關(guān)性以及在治療前后的動態(tài)變化規(guī)律。
　　 結(jié)果：
　　 1.各組模型鼠體內(nèi)血吸蟲蟲體檢測發(fā)現(xiàn):在各組感染小鼠體內(nèi)均可見數(shù)量不等雌雄合抱的活蟲體，在各組治療小鼠體內(nèi)則均未觀察到活蟲體。
　　 2.肝腸組織切片中蟲卵AKP染色結(jié)果顯示:在感染后45d組，兩種方法檢測兩種切片中蟲卵陽性率均在95％以上，用偶氮偶聯(lián)法和NBT/BCIP兩種AKP染色法及VON KOSSA染色法對肝腸組織切片中蟲卵進行比較檢

5、測觀察，計數(shù)顯色和不顯色的蟲卵數(shù)，依據(jù)蟲卵顯色陽性率，比較分析三種染色法對血吸蟲死卵和活卵鑒定的效果。感染后120d組，其陽性率顯著減低，在治療鼠中，T2M和T3M兩組腸黏膜內(nèi)蟲卵陽性率降為0，但肝組織內(nèi)仍有陽性卵，并在T3M組仍有1.4％-5.29％的陽性率;AKP兩種方法在檢測蟲卵總體效果上差異無顯著性(p＞0.05)，在肝和腸二者間（陽性率）呈正相關(guān)性（秩相關(guān)系數(shù)為0.876，相關(guān)系數(shù)檢驗p＜0.01），但在結(jié)腸黏膜中檢出的陽性蟲

6、卵率(49.12％-75.45％)普遍要高于肝組織內(nèi)的(30.48％-49.92％)，其差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。
　　 3.肝和腸組織切片中蟲卵鈣化物檢測結(jié)果顯示:在I45d組均未見鈣化顯色卵，I90d和I120d兩組的蟲卵鈣化率分別為48％和45％（腸）及51％和62％（肝）;在T1M、T2M和T3M組中，蟲卵鈣化率分別為45％、95％和95％（腸）及22％、86％和96％（肝）;各組蟲卵鈣化率在肝和腸二者間呈正相關(guān)

7、，（相關(guān)系數(shù)為0.841，p＜0.05），但在T3M鼠組織中仍然存在極少數(shù)未鈣化卵。
　　 4.感染45d小鼠肝腸組織內(nèi)僅有少量膠原沉積，隨感染后時間延長，膠原范圍增大，主要分布于蟲卵周圍與肝板間。在感染45d經(jīng)吡喹酮有效殺蟲后的小鼠肝腸組織可見明顯的膠原沉積。
　　 5.與N組比，肝組織中感染組和治療組PDI水平與N均表達增高，其中在I90d組表達水平為最高，(與其他各組比，差異有顯著性，p＜0.05);治療組PDI表

8、達量下降，與感染各組比，其差異有顯著性降低。結(jié)腸黏膜內(nèi)PDI表達水平，與正常組相比，各組PDI表達均增高，其中I90d組和I120d組的表達水平較其他各組均顯著增高(p＜0.05);治療組PDI表達量與I90d組和120d組比，有顯著下降(p＜0.05)。PDI表達水平在各模型鼠的肝和腸二者間有相關(guān)性(pearson相關(guān)系數(shù)為0.377，相關(guān)系數(shù)檢驗p＜0.05)。
　　 6.肝腸組織中ATPase表達主要分布于蟲卵結(jié)節(jié)周圍與內(nèi)

9、部，其活性水平在感染各組和T1M組中均增高，與T2M和T3M及N三組比，其差異有顯著性(p＜0.05)。T2M和T3M與正常鼠之間ATPase表達差異無顯著性(p＞0.05)。ATPase表達水平在各模型鼠的肝和腸二者間也有相關(guān)性(pearson相關(guān)系數(shù)為0.509，相關(guān)系數(shù)檢驗p＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 對Sj感染45d鼠作病原有效治療后，仍可見肝腸纖維化在發(fā)展，表明對其治療需從抗病原和抗纖維化兩方面進行;檢