棕櫚酸對βTC6細胞PANDER表達的影響及Exendin-4的保護作用.pdf

1、目的：用不同濃度棕櫚酸（PA）干預小鼠胰島細胞瘤系βTC6細胞不同時長，并加用c-jun氨基末端激酶（JNK）特異性抑制劑SP600125，觀察JNK信號轉(zhuǎn)導通路關鍵蛋白JNK及其下游底物c-jun磷酸化情況，以及胰腺衍生因子（PANDER）的表達變化，探討PA對β細胞PANDER表達的影響及JNK信號轉(zhuǎn)導通路在其中的作用；建立小干擾RNA（siRNA）沉默PANDER表達，觀察βTC6細胞PANDER沉默前后脂性凋亡的變化以及凋亡關鍵

2、分子caspase-3的活性變化，探討PA作用下PANDER上調(diào)對β細胞脂性凋亡的影響及可能機制；加用胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）受體長效激動劑Exendin-4處理細胞，觀察Exendin-4對PA作用下βTC6細胞凋亡及PANDER表達的影響，以及在這一過程中JNK信號通路和caspase-3的活性變化，探討Exendin-4拮抗β細胞脂性凋亡的可能機制，為臨床新藥開發(fā)提供一定的實驗和理論依據(jù)。文章主要從以下幾部分展開論述：

3、r>　　第一部分 棕櫚酸對βTC6細胞PANDER表達的影響
　　方法：（1）分別以不同濃度PA（0，0.125，0.25，0.5或1.0mmol/L）干預βTC6細胞不同時長（0，6，12，24或48 h），用實時熒光RT-PCR法及Western blot法檢測PANDER mRNA及蛋白的表達變化；（2）以0.5mmol/L的PA干預βTC6細胞0，0.1，0.25，0.5，1，6，12和24 h，應用Western blo

4、t法，使用能特異識別JNK、c-jun的磷酸化位點的抗體來檢測JNK, c-jun的磷酸化水平，從而說明這兩種蛋白的活化程度；（3）將βTC6細胞分為四組，分別為對照組、PA組（0.5mmol/L的PA干預24 h）、SP600125組（25umol/L SP600125處理細胞24 h）和PA+SP600125組（25umol/L SP600125預處理細胞1 h，再予25umol/L SP600125+0.5mmol/L PA處理細

5、胞24h），應用Western blot法檢測PANDER、p-JNK、JNK、c-jun、p-c-jun的變化。
　　結(jié)果：（1）PA可上調(diào)βTC6細胞PANDER表達，在mRNA水平，PA的作用高峰為0.5mmol/L，干預12 h；而在蛋白水平，PA的作用高峰出現(xiàn)在0.5mmol/L，干預24 h。（2）PA可致JNK通路活化，且有兩個高峰，分別出現(xiàn)在PA干預6min及12h。（3）應用SP600125可有效抑制PA誘導的J

6、NK及其下游c-jun磷酸化，且PA誘導的PANDER表達隨之降低。
　　結(jié)論：PA通過活化JNK信號轉(zhuǎn)導通路上調(diào)β細胞PANDER表達。
　　第二部分 PANDER在PA所致的βTC6細胞脂性凋亡中的作用
　　方法：（1）根據(jù)小鼠PANDER基因（GenBank Accession Number:52793）的序列，選擇6個位點，于體外設計并合成 siRNA。評估轉(zhuǎn)染效率后，以Lipofectamine2000作為載

7、體進行瞬時轉(zhuǎn)染。同時設置空白對照組（Blank Control， BC），陰性對照組（Negative Control，NC）以及轉(zhuǎn)染試劑組暴露組（mock）。應用實時熒光PT-PCR及Western blot法檢測各組PANDER mRNA及蛋白表達情況。（2）將βTC6細胞分NC組，siRNA組，NC+PA組及siRNA+PA組進行干預。PA的干預濃度和時間根據(jù)第一部分實驗結(jié)果選擇，為0.5 mmol/L，24h。用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)

8、移酶介導的dUTP缺口末端標記測定法（terminal dexynucleotidyl transferase(TdT)-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL）和Annexin V-FITC-PI雙染，流式細胞術檢測細胞凋亡。用Western blot法檢測caspase-3蛋白水解后的兩個亞單位，評估caspase3活化程度。
　　結(jié)果：（1）應用序列Fam3b-mus-208可抑制PAND

9、ER基因表達，與NC組相比，在mRNA水平，抑制率達78％，在蛋白水平，抑制率約為60%，可用于后續(xù)實驗；（2）PA干預后，NC組細胞caspase-3活化，凋亡顯著增加；轉(zhuǎn)染PANDER siRNA的細胞caspase-3活化減少，細胞凋亡率有所降低。
　　結(jié)論：PA可能通過上調(diào)PANDER表達進而活化caspase-3誘導胰島β細胞凋亡。
　　第三部分 Exendin-4對βTC6細胞脂性凋亡的保護作用
　　方法：

10、（1）以濃度逐漸升高的Exendin-4（12.5，25，50或100nmol/L）預處理βTC6細胞24 h，再予相應濃度的Exendin-4聯(lián)合0.5mmol/L PA共同干預βTC6細胞24h，用Western blot法檢測細胞PANDER蛋白表達。（2）將βTC6細胞分對照組、Exendin-4組、PA組及Exendin-4+PA組進行干預。PA的干預濃度和時間根據(jù)第一部分實驗結(jié)果選擇，為0.5 mmol/L，24h。Exen

11、din-4的干預濃度根據(jù)本部分第一小節(jié)實驗結(jié)果選擇，為50nmol/L，預孵育細胞24 h后再與0.5 mmol/L PA共同干預24 h。用TUNEL法和Annexin V-FITC-PI雙染，流式細胞術檢測細胞凋亡。用Western blot法檢測細胞PANDER、p-JNK、JNK、c-jun、p-c-jun及cleaved caspase-3表達的變化。
　　結(jié)果：（1）Exendin-4濃度依賴性降低PA誘導的βTC6細