蜂膠活性成分抗心肌細(xì)胞氧化性損傷的作用及機(jī)制研究.pdf

1、心肌細(xì)胞氧化性損傷是心血管系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能異常的重要原因之一。尋找及開發(fā)保護(hù)心肌細(xì)胞氧化損傷性的天然物質(zhì)是防治心血管疾病的前提。蜂膠是一種天然的活性物質(zhì)，具有多重生物學(xué)活性，如抗氧化、抗菌、抗炎、抗腫瘤等。本文從蜂膠中分離、篩選出了抗心肌細(xì)胞氧化損傷作用較強(qiáng)的活性物質(zhì)以及研究了抗氧化作用機(jī)制，為心血管疾病的防治提供物質(zhì)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。
　　本文采用乙醇提取、層析分離、制備型高效液相色譜（HPLC）并結(jié)合液相-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS），

2、從蜂膠中分離、純化并鑒定出6種化合物。以CCK-8法測(cè)得的H9c2心肌細(xì)胞存活率為指標(biāo)確定了700μmol/L和4 h為H2O2氧化損傷條件，篩選出了6種蜂膠中具有抗心肌細(xì)胞氧化損傷作用的活性物質(zhì)，其中三種咖啡酸酯類物質(zhì)咖啡酸芐酯、咖啡酸苯乙酯（CAPE）和咖啡酸肉桂酯的抗氧化活性高于兩種黃酮類物質(zhì)白楊素、短葉松素和一種酚酸類物質(zhì)3,4-二甲氧基肉桂酸（DMCA）。以1μmol/L、5μmol/L和10μmol/L為三個(gè)預(yù)處理濃度，分別

3、從生化水平和分子水平研究了咖啡酸芐酯、CAPE和咖啡酸肉桂酯抗心肌細(xì)胞氧化性損傷的作用機(jī)制，采用相關(guān)試劑盒測(cè)定了超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）活力和丙二醛（MDA）含量，離子比例/成像系統(tǒng)測(cè)定了胞內(nèi)游離鈣離子濃度（[Ca2+]i）；Annexin V-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞儀測(cè)得了細(xì)胞凋亡率和半定量PCR（RT-PCR）法測(cè)定Bcl-2、Bax和半胱天冬酶-3（Caspase-3） mRNA表達(dá)水

4、平。結(jié)果：
　?。?）經(jīng)H2O2誘導(dǎo)致?lián)pH9c2心肌細(xì)胞的MDA含量明顯升高，SOD活力和GSH-Px活力明顯降低，且與正常組細(xì)胞呈極顯著差異（P<0.01）。分別用1、5和10μmol/L的咖啡酸芐酯、CAPE、咖啡酸肉桂酯和5μmol/L的陽(yáng)性對(duì)照槲皮素預(yù)處理12 h后，再對(duì)心肌細(xì)胞進(jìn)行氧化損傷處理。結(jié)果，各濃度的供試品以及陽(yáng)性對(duì)照都不同程度地降低了MDA含量，升高了SOD和GSH-Px活力，且呈現(xiàn)劑量依賴性的作用。
　

5、?。?）H9c2心肌細(xì)胞氧化損傷后[Ca2+]i極顯著高于正常組（P<0.01）。咖啡酸芐酯、CAPE和咖啡酸肉桂酯預(yù)處理后，[Ca2+]i呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，且隨供試品濃度增大，下降程度越大。其中，各物質(zhì)高濃度預(yù)處理后，[Ca2+]i僅為損傷組的約2/3。
　　（3）經(jīng)H2O2氧化損傷誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞凋亡，受損細(xì)胞中Bcl-2的mRNA表達(dá)水平下降，Bax和Caspase-3的mRNA表達(dá)水平增強(qiáng)。經(jīng)咖啡酸芐酯、CAPE和咖啡酸肉

6、桂酯干預(yù)后，Bcl-2的mRNA表達(dá)上調(diào)，Bax和Caspase-3的mRNA表達(dá)下調(diào)，說(shuō)明咖啡酸芐酯、CAPE和咖啡酸肉桂酯有效抑制氧化損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。
　　蜂膠中咖啡酸酯類物質(zhì)（咖啡酸芐酯、CAPE和咖啡酸肉桂酯）與黃酮類物質(zhì)（白楊素、短葉松素）一樣均具有保護(hù)氧化損傷性心肌細(xì)胞的作用，其作用機(jī)制可能是通過(guò)保護(hù)抗氧化酶、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)、降低[Ca2+]i和改善細(xì)胞凋亡現(xiàn)象實(shí)現(xiàn)的。其抗凋亡作用可能是通過(guò)調(diào)控與凋亡相關(guān)基因的