冠心丹參方對(duì)氧化應(yīng)激性心肌細(xì)胞損傷保護(hù)作用的物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制研究.pdf

1、缺血性心臟病(又稱冠心病,coronary artery disease,CAD)具有較高的發(fā)病率及致死率,是威脅人類健康的嚴(yán)重疾病之一。近年來(lái)其發(fā)病年齡逐漸有年輕化的趨勢(shì),因而引起了廣泛的關(guān)注。
　　 越來(lái)越多的研究認(rèn)為,心肌細(xì)胞凋亡是CAD發(fā)生發(fā)展過(guò)程中引起心肌細(xì)胞損傷進(jìn)而死亡的重要原因。細(xì)胞凋亡主要由兩條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)激活,即內(nèi)源性通路(線粒體通路)和外源性通路(死亡受體通路)。內(nèi)源性通路始于各種刺激因素導(dǎo)致線粒體膜通透性的改變

2、,使促凋亡因子細(xì)胞色素C等釋放至細(xì)胞漿而激活caspase-9。而在外源性通路中,當(dāng)死亡受體與相應(yīng)的配體結(jié)合后激活caspase-8。兩條通路最終都通過(guò)激活caspase-3而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡性死亡的特征性改變。氧化應(yīng)激是這些心血管疾病病理過(guò)程中導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡的重要因素。氧化應(yīng)激是指部分還原形態(tài)的氧離子即活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)的生成超過(guò)了細(xì)胞內(nèi)源性解毒和/或使用能力的非穩(wěn)態(tài)狀態(tài)?；钚匝踉诩?xì)胞

3、內(nèi)的異常聚集可導(dǎo)致重要生物大分子的損傷性氧化修飾,通過(guò)不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路引起細(xì)胞功能及結(jié)構(gòu)的改變,最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。因此尋找有效的抗氧化劑對(duì)于抑制心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生及CAD的治療具有重要的意義。
　　 冠心丹參方是由丹參、三七、降香三味藥組成的,具有活血化瘀、行氣止痛之功效,臨床上主要用于心血管疾病的治療。以往的研究顯示,抗氧化作用是冠心丹參方發(fā)揮心血管保護(hù)作用的重要機(jī)制之一,但對(duì)方中有效成分抗氧化活性的系統(tǒng)分析及比較研究較少。

4、因此,本研究采用體外心肌細(xì)胞培養(yǎng),以H2O2造成氧化應(yīng)激性損傷模型,分析冠心丹參方對(duì)H2O2誘導(dǎo)的氧化性心肌細(xì)胞損傷保護(hù)作用的物質(zhì)基礎(chǔ),并進(jìn)一步探討其作用機(jī)制,為從現(xiàn)代分子生物學(xué)水平上闡明中藥復(fù)方有效性及作用機(jī)理提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 本課題分為三個(gè)部分:
　　 第一部分冠心丹參方對(duì)H2O2誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞損傷的物質(zhì)基礎(chǔ)研究實(shí)驗(yàn)?zāi)康?觀察冠心丹參方中主要活性成分對(duì)H2O2引起的H9c2心肌細(xì)胞損傷的影響。
　　

5、 實(shí)驗(yàn)方法:冠心丹參方中不同濃度主要活性成分丹參中丹酚酸B及丹參酮ⅡA磺酸鈉,三七中人參皂苷Rb1及三七皂苷R1,降香中黃酮類化合物木犀草素預(yù)孵育相應(yīng)時(shí)間后,150μM H2O2作用6 h。MTT法檢測(cè)各活性成分對(duì):H9c2心肌細(xì)胞活力的影響。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:除三七皂苷R1外,丹酚酸B、丹參酮ⅡA磺酸鈉、人參皂苷Rb1以及木犀草素預(yù)孵育4 h對(duì)H2O2誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞損傷均具有不同程度的保護(hù)作用,其中以木犀草素的抗氧化性

6、損傷作用最強(qiáng)。木犀草素在預(yù)孵育1 h后即表現(xiàn)出顯著的抗氧化性細(xì)胞損傷的作用。三七皂苷R1在預(yù)孵育24 h后對(duì)H2O2引起的細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。
　　 結(jié)論:在H2O2誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞損傷模型上,降香中黃酮類化合物抗氧化作用最顯著,是冠心丹參方中發(fā)揮抗氧化活性的主要成分。冠心丹參方中的主要活性成分在不同時(shí)間點(diǎn)上發(fā)揮了作用,體現(xiàn)了其抗氧化作用在不同時(shí)間上的協(xié)同效應(yīng)。
　　 第二部分黃酮類化合物對(duì)H2O2誘導(dǎo)H9c2心肌

7、細(xì)胞損傷的保護(hù)作用研究及構(gòu)效關(guān)系分析
　　 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?觀察黃酮類化合物對(duì)H2O2誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。
　　 實(shí)驗(yàn)方法:黃酮類化合物的代表性苷元化合物:木犀草素,槲皮素,柚皮素,二氫槲皮素及兒茶素預(yù)孵育1 h后,150μM H2O2作用6 h。黃酮糖苷化合物木犀草苷,黃岑苷,蘆丁,楊梅苷,甘草苷和柚皮苷預(yù)孵育4 h后,150μM H2O2作用6 h。MTT法檢測(cè)各活性成分對(duì)H9c2心肌細(xì)胞活力的影響。

8、>　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:在對(duì)H2O2誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞氧化性損傷的模型上,黃酮苷元按保護(hù)作用由強(qiáng)到弱依次為:槲皮素>木犀草素>兒茶素>二氫槲皮素>柚皮素,黃酮糖苷的保護(hù)作用由強(qiáng)到弱依次為:木犀草苷>蘆丁>黃岑苷>楊梅苷>甘草苷和柚皮苷。結(jié)論:在所研究的黃酮苷元化合物中,黃酮醇類化合物槲皮素和黃酮類化合物木犀草素對(duì)H2O2誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞損傷保護(hù)作用較強(qiáng),而黃酮糖苷類化合物中木犀草苷的保護(hù)作用較強(qiáng)。從結(jié)構(gòu)上分析,羥基的數(shù)目、C環(huán)3位的

9、羥基、C-2和C-3之間的雙鍵以及C環(huán)4位上的羰基、糖基的存在均對(duì)其抗氧化活性具有不同程度的影響。
　　 第三部分黃酮類化合物木犀草苷對(duì)H2O2誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用及機(jī)制研究
　　 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?研究降香中黃酮類化合物木犀草苷對(duì)H2O2引起的H9c2心肌細(xì)胞凋亡的影響及探討其可能的作用機(jī)制。
　　 實(shí)驗(yàn)方法:木犀草苷預(yù)處理H9c2細(xì)胞4 h后,150uM H2O2作用6 h。采用Hoechst33342

10、熒光染色及TUNEL法進(jìn)行細(xì)胞核形態(tài)學(xué)觀察,Annexin V FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)及Caspase蛋白酶活性分析木犀草苷對(duì)H2O2誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞凋亡的影響。通過(guò)檢測(cè)內(nèi)源性抗氧化酶SOD、GSH-Px、CAT活性,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平及線粒體膜電位,Western blot分析凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的變化研究木犀草苷對(duì)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的可能的作用機(jī)制。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:H2O2嚴(yán)重?fù)p傷H9c2細(xì)胞并伴有

11、顯著的凋亡特征:細(xì)胞核形態(tài)改變?nèi)缛旧|(zhì)濃縮、邊集及Caspase-3的激活等。木犀草苷預(yù)處理可顯著降低凋亡細(xì)胞的比例。木犀草苷可增強(qiáng)內(nèi)源性抗氧化酶SOD,GSH-Px,CAT的活性,因而抑制細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基的生成。另外,木犀草苷預(yù)處理可顯著抑制H2O2引起的Caspase酶活性的增加,抑制線粒體膜電位的下降,并增加抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá),降低促凋亡蛋白bax的表達(dá),從而抑制促凋亡因子(細(xì)胞色素C和smac)從線粒體的釋放,穩(wěn)定線粒