自噬-NF-κB環(huán)路介導心肌細胞抗缺血作用的機制研究.pdf

1、目的:建立H9C2心肌細胞氧葡萄糖剝奪（OGD）模型模擬體內(nèi)心肌缺血，觀察自噬對氧葡萄糖剝奪處理引起H9C2心肌細胞受損的影響，并研究該過程中自噬是否通過影響 NF-κB而發(fā)揮作用，從而為揭示自噬參與抗缺血損傷的分子機制。
　　方法:通過對 H9C2心肌細胞進行氧葡萄糖剝奪處理，建立心肌缺血模型。采用Western-blot法和pEGFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染檢測氧葡萄糖剝奪后自噬相關(guān)蛋白LC3、Beclin1和P62的表達變化情況以及

2、不同時間點氧葡萄糖剝奪處理后心肌細胞GFP-LC3點狀聚集物數(shù)目的變化；采用MTT法和臺盼藍染色法檢測給予自噬增強劑雷帕霉素對氧葡萄糖剝奪處理后心肌細胞的存活率；采用Western-blot法和免疫熒光法檢測NF-κB在自噬介導的心肌細胞抗缺血損傷中的作用。
　　結(jié)果:
　　1.與正常對照組相比，在OGD處理0.5h到2h過程中自噬相關(guān)蛋白LC3和Beclin-1的表達水平顯著升高，而在2h時P62蛋白水平相應明顯下降。隨后

3、，在2h到12h過程中LC3和Beclin-1的表達水平逐漸降低，在12h時P62水平顯著升高。為了進一步證明自噬流的情況，采用溶酶體抑制劑氯喹處理2h后OGD處理12h，發(fā)現(xiàn)OGD處理后P62明顯堆積，而給予氯喹后進行 OGD處理對 P62的水平?jīng)]有明顯變化。
　　2.對經(jīng)pEGFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的H9C2細胞進行不同時間的氧葡萄糖剝奪處理，在0.5h到2h之間GFP-LC3熒光斑點增加，自噬增強；在直到12h的處理時間中，G

4、FP-LC3熒光斑點逐漸下降到基線水平。
　　3. MTT和臺盼藍染色的結(jié)果表明，在氧葡萄糖剝奪處理的H9C2心肌細胞中，給予Rapamycin增強自噬可以明顯提高細胞的存活率。反之，使用3-MA或siATG5抑制自噬會顯著降低細胞存活率。
　　4. Western-blot結(jié)果顯示，增強自噬能夠抑制小鼠心梗后 NF-κB的磷酸化；使氧葡萄糖剝奪處理后H9C2心肌細胞中核蛋白 P65表達水平降低，胞漿蛋白 IκB-α的表達水

5、平升高。通過免疫熒光法檢測結(jié)果也顯示，增強自噬抑制氧葡萄糖剝奪對H9C2心肌細胞NF-κB核轉(zhuǎn)位的影響。
　　5. Western-blot結(jié)果顯示，抑制 NF-κB能夠明顯上調(diào)氧葡萄糖剝奪處理4h的H9C2心肌細胞中LC3蛋白的表達水平，同時檢測到P62蛋白表達明顯下降。從免疫組化的結(jié)果中也可以看出，抑制NF-κB信號通路能夠增多GFP-LC3活性細胞和點狀聚集物，反過來正反饋增強自噬。
　　結(jié)論:給予Rapamycin增