靶向沉默蛋白激酶Polo-like Kinase1治療骨肉瘤的實驗研究.pdf

1、骨肉瘤是一種常見于兒童和青少年的原發(fā)性惡性骨腫瘤,其惡性程度高,發(fā)展迅速。骨肉瘤多發(fā)生于骨端,偶發(fā)于骨骺或骨干。其治療方法包括外科手術(shù)切除及新輔助化療。相比單純手術(shù)治療,新輔助化療聯(lián)合手術(shù)治療可將骨肉瘤患者生存率由11％提高到60-70％。已接受一線化療藥物治療的晚期骨肉瘤患者常需要追加多個療程化療,因此化療藥物的毒性作用更加明顯。經(jīng)過系統(tǒng)治療后許多患者腫瘤仍會復(fù)發(fā),一旦復(fù)發(fā)其生存時間將大大縮短。很不幸的,過去20年人類在治療骨肉瘤領(lǐng)域

2、沒有取得長足的進(jìn)步,患者生存率未得到明顯提高。因此,發(fā)現(xiàn)新的治療骨肉瘤的生物靶點是未來制定個性化治療方案的重要一環(huán)。
　　在該項研究中,在骨肉瘤細(xì)胞系(KHOS和U2OS)中使用慢病毒短發(fā)卡 RNA庫(lentiviral short hairpin RNA)系統(tǒng)的篩選人類已知的激酶組。當(dāng)慢病毒 shRNA被轉(zhuǎn)導(dǎo)入骨肉瘤細(xì)胞系后,發(fā)現(xiàn)許多蛋白激酶,包括絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶 Polo樣激酶1(PLK1)的基因表達(dá)被沉默,骨肉瘤細(xì)胞

3、的生長受到抑制并逐漸發(fā)生細(xì)胞凋亡?；パa(bǔ)脫氧核糖核酸挽救實驗(cDNA rescue assay)和合成小干擾核糖核酸轉(zhuǎn)染實驗證實骨肉瘤細(xì)胞系表型發(fā)生變化的原因為 PLK1基因表達(dá)的缺失。Western blotting蛋白免疫印跡實驗同樣也顯示蛋白激酶 PLK1在各種不同骨肉瘤細(xì)胞系以及手術(shù)切除的骨肉瘤組織標(biāo)本中被廣泛激活并且大量表達(dá)。
　　蛋白激酶 PLK1的小分子抑制物 BI2536能夠在二維和三位培養(yǎng)系統(tǒng)抑制骨肉瘤細(xì)胞 KH

4、OS和U2OS的增殖并誘發(fā)細(xì)胞凋亡。通過在二維和三維培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)胞增殖實驗,我們證實 BI2536可以抑制骨肉瘤細(xì)胞生長。使用一定濃度 BI2536處理細(xì)胞后,細(xì)胞周期發(fā)生明顯變化,大部分細(xì)胞停滯于 G2/M期。免疫熒光和Western blotting蛋白免疫印跡實驗顯示 BI2536能明顯抑制PLK1和誘導(dǎo)髓樣細(xì)胞白血病分化蛋白1(Mcl-1)的表達(dá),且抑制作用呈劑量依賴性和時間依賴性。另外,檢測出凋亡相關(guān)蛋白 PARP及其裂解物

5、的表達(dá)和水解酶實驗進(jìn)一步證實 BI2536能夠誘發(fā)細(xì)胞凋亡。最后構(gòu)建骨肉瘤動物模型,發(fā)現(xiàn)接受 BI2536治療的小鼠,其骨肉瘤體積明顯小于對照組。通過收集良好隨訪的骨肉瘤患者腫瘤組織,制作了腫瘤組織微陣列并使用免疫組織化學(xué)的方法對不同組織中的PLK1蛋白進(jìn)行標(biāo)記染色。PLK1表達(dá)水平高的患者其總體生存率和生存時間要明顯低于表達(dá)水平低的患者。
　　上述結(jié)果顯示采用高通量篩選技術(shù)篩選人類激酶組對于發(fā)現(xiàn)治療腫瘤的潛在靶向藥物有極大幫助,