siRNA沉默Polo-like kinase1基因體內(nèi)外實驗探討其在肝癌中過表達的作用機制.pdf

1、目的：
　　 1.了解polo-like kinase 1 (Plk1)基因在正常肝組織、癌旁組織及肝癌組織的表達差異。
　　 2.建立穩(wěn)定表達Plk1沉默的人肝癌BEL-7402細(xì)胞亞株-Plk1 siRNA251細(xì)胞，檢測其Plk1表達水平及其細(xì)胞周期的變化情況。
　　 3.建立Plk1siRNA251細(xì)胞及肝癌BEL-7402細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤模型，比較兩組移植瘤生長及病理檢測的差異。
　　 4.免

2、疫組化、半定量RT-PCR及Western blot技術(shù)檢測Plk1過表達與Cdc25c及survivin的關(guān)系。
　　 方法：
　　 1.免疫組織技術(shù)了解人肝癌細(xì)胞癌標(biāo)本中Plk1的表達部位;RT-PCR,Western blot檢測Plk1基因mRNA及蛋白質(zhì)表達水平。
　　 2.合成、鑒定Plk1 siRNA質(zhì)粒;電轉(zhuǎn)染siRNA質(zhì)粒于人肝癌BEL-7402細(xì)胞，經(jīng)G418篩選獲得穩(wěn)定表達沉默Plk1的人肝

3、癌BEL-7402細(xì)胞株(Plk1 siRNA251細(xì)胞)。RT-PCR, Western blot檢測Plk1siRNA 251及肝癌BEL-7402細(xì)胞Plk1的表達水平;流式細(xì)胞儀檢比較它們細(xì)胞周期的變化。
　　 3，建立Plk1siRNA 251及人肝癌BEL-7402細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤模型，比較它們在成瘤時間、成瘤率、及腫瘤生長變化的差異，繪制移植瘤生長曲線圖;H.E染色及Tunel試驗檢測腫瘤壞死及凋亡情況。

4、　　 4.兩組移植瘤組織行免疫組化檢測Plk1及Survivin的表達。RT-PCR及Western blot檢測它們Cdc25c及survivin的mRNA及蛋白質(zhì)表達水平。
　　 結(jié)果：
　　 1.免疫組化檢測Plk1在肝癌組織呈陽性表達，在癌旁及正常肝組織呈弱陽性及陰性表達。RT-PCR及Western blot檢測:肝癌組織Plk1mRNA及蛋白質(zhì)表達水平明顯高于癌旁組織及正常肝組織( p<0.01)。

5、　　 2.將成功獲取Plk1siRNA251質(zhì)粒經(jīng)電轉(zhuǎn)染入人肝癌BEL-7402細(xì)胞，經(jīng)G418篩選獲取Plk1siRNA251細(xì)胞，與人肝癌BEL-7402細(xì)胞相比，Plk1siRNA251細(xì)胞Plk1的mRNA及蛋白質(zhì)呈低表達水平;且多停滯于G2/M期。
　　 3.成功建立Plk1siRNA251與人肝癌BEL-7402細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤模型，這兩組移植瘤模型在成瘤時間、成瘤率、及腫瘤生長速度上有統(tǒng)計學(xué)差異;H.E染色及T

6、unel檢測發(fā)現(xiàn)兩者移植瘤細(xì)胞形態(tài)上沒有明顯改變，但Plk1 siRNA251移植瘤組存大量核固縮及凋亡小體，而BEL-7402移植瘤組核固縮及凋亡小體少見。高倍顯微鏡下凋亡小體計數(shù)，兩者有顯著性差異(p<0.01)。
　　 4.Plk1siRNA251組及BEL-7402組移植瘤mRNA及Western blot檢測行Cdc25c及survivin的表達有顯著性差異(p<0.01)。免疫組織檢測顯示:Plk1siRNA251組

7、移植瘤的Plk1及Survivin呈陰性表達。而BEL-7402組移植瘤呈陽性表達。提示Plk1的過表達可能引起Cdc25c及survivin表達水平增高。
　　 結(jié)論：
　　 1.Plk1在肝癌組織中過表達，癌旁肝硬化的及正常組織中低表達。
　　 2.與肝癌BEL-7402細(xì)胞相比，Plk1siRNA251細(xì)胞Plk1的mRNA及蛋白質(zhì)呈低表達水平，且多停滯于G2/M期。
　　 3.與BEL-7402移

8、植瘤比較，Plk1siRNA251組移植瘤在成瘤時間、成瘤率、及腫瘤生長速度上有統(tǒng)計學(xué)差異，Plk1siRNA251組移植瘤存在明顯的凋亡小體。
　　 4.Plk1siRNA251與BEL-7402移植瘤組織的Cdc25c、survivin的mRNA及蛋白質(zhì)水平存在差異。Plk1siRNA251組移植瘤Plk1及survivin免疫組化呈陰性表達而BEL-7402組移植瘤免疫組化呈陽性表達。Plk1過表達的致癌作用可能是促進肝癌