RNA干擾沉默缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α基因治療骨肉瘤的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、一.HIF-1α在骨肉瘤中的表達(dá)及意義 目的:探討缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)在骨肉瘤中的表達(dá)及臨床意義。 方法:采用免疫組織化學(xué)方法(SP法)，檢測(cè)了48例骨肉瘤和10例正常骨組織中HIF-1α和VEGF的表達(dá)，分析兩種基因表達(dá)的相關(guān)性，并對(duì)有關(guān)臨床和病理指標(biāo)綜合分析。 結(jié)果:HIF-1α在骨肉瘤中表達(dá)陽(yáng)性率為43.8％，而正常骨組織中均為陰性表達(dá)；HIF-1α和VEGF基因表達(dá)之間顯著正相關(guān)(x2=4.

2、769,P=0.029)；HIF-1α的表達(dá)與年齡、性別、腫瘤的體積大小、Dahlin分型無(wú)關(guān)(P＞.05)，而與骨肉瘤臨床分期、軟組織浸潤(rùn)以及Price分級(jí)密切相關(guān)(P＜0.05)。 結(jié)論：HIF-1α的高表達(dá)參與了骨肉瘤的惡性進(jìn)展，可能通過(guò)刺激VEGF表達(dá)促進(jìn)缺氧環(huán)境下骨肉瘤的血管新生，可作為新的分子靶點(diǎn)應(yīng)用于骨肉瘤診斷、基因治療和預(yù)后判斷。 二.缺氧對(duì)骨肉瘤SaOS-2細(xì)胞生物學(xué)特性的影響 目的:觀(guān)察體外缺

3、氧條件下骨肉瘤SaOS-2生物學(xué)特性的改變。 方法:建立骨肉瘤細(xì)胞體外缺氧培養(yǎng)模型。流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期改變。劃痕損傷法和Boyden侵襲小室檢測(cè)細(xì)胞體外侵襲遷移能力的變化。觀(guān)察缺氧培養(yǎng)不同時(shí)相(8h，16h，24h)HIF-1α和VEGF的表達(dá)。半定量RT-PCR方法檢測(cè)HIF-1α和VEGFmRNA的轉(zhuǎn)錄水平，免疫組化(SP法)檢測(cè)骨肉瘤細(xì)胞中HIF-1α和VEGF蛋白表達(dá)情況，BLISA法檢測(cè)培養(yǎng)上清中VEGF蛋白表達(dá)。

4、 結(jié)果:缺氧培養(yǎng)16h內(nèi)，細(xì)胞周期表現(xiàn)為G1期阻滯。24小時(shí)后，細(xì)胞周期恢復(fù)常氧狀態(tài)。缺氧培養(yǎng)24h后，骨肉瘤細(xì)胞體外遷移和侵襲能力明顯增強(qiáng)。缺氧處理后，HIF-1αmRNA轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有明顯改變，蛋白表達(dá)升高。VEGFmRNA以及蛋白的表達(dá)在缺氧條件下均顯著增強(qiáng)。 結(jié)論:骨肉瘤細(xì)胞存在缺氧耐受機(jī)制，通過(guò)一系列生物學(xué)特性的改變來(lái)應(yīng)對(duì)缺氧帶來(lái)的不利。 三.HIF-1α短發(fā)夾狀小RNA干擾載體的構(gòu)建及鑒定 目的

5、:構(gòu)建低氧誘導(dǎo)因子HIF-1α發(fā)夾狀小干涉RNA真核表達(dá)載體，觀(guān)察發(fā)夾狀雙鏈小干涉RNA對(duì)骨肉瘤細(xì)胞HIF-1α的轉(zhuǎn)錄后的基因沉默效果。 方法:體外合成兩對(duì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈，分別針對(duì)缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1αmRNA序列的兩個(gè)靶位點(diǎn)。退火形成雙鏈，插入pSilencerTMneoU62.1真核表達(dá)載體。將構(gòu)建好的載體經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染骨肉瘤SaOS-2細(xì)胞，觀(guān)察HIF-1α基因的沉默效果。半定量RT-PCR檢測(cè)HIF-1αmRNA的

6、抑制程度，免疫熒光和免疫印跡(WesternBlot)檢測(cè)HIF-1α蛋白表達(dá)情況。 結(jié)果:測(cè)序證實(shí)成功構(gòu)建HIF-1α發(fā)夾狀小干涉RNA真核表達(dá)載體。轉(zhuǎn)錄生成的發(fā)夾狀小干涉能夠特異抑制HIF-1α表達(dá)。RT-PCR結(jié)果顯示針對(duì)HIF-1αmRNA序列的兩個(gè)靶位點(diǎn)的沉默效果分別為69％和92％，免疫熒光顯示轉(zhuǎn)染后熒光強(qiáng)度顯著降低，免疫印跡顯示兩個(gè)靶位點(diǎn)的發(fā)夾狀小干涉RNA分被使HIF-1α蛋白表達(dá)下降66％和90％。 結(jié)

7、論:通過(guò)體內(nèi)轉(zhuǎn)錄生成的發(fā)夾狀小干涉RNA能夠使骨肉瘤細(xì)胞缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α基因沉默。 四.靶向HIF-1α的siRNA治療骨肉瘤的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究 目的:觀(guān)察靶向缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α的短發(fā)夾狀小干擾RNA基因轉(zhuǎn)染對(duì)骨肉瘤生長(zhǎng)的影響。 方法:針對(duì)HIF-1α構(gòu)建短發(fā)夾狀小干擾RNA真核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染骨肉瘤細(xì)胞系SaOS-2。骨肉瘤細(xì)胞置于缺氧誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。MTT比色分析檢測(cè)細(xì)胞體外增殖活力，DNA凝膠電

8、泳、透射電鏡、原位末端標(biāo)記TUNEL法、AnnexinV/PI雙標(biāo)記法檢測(cè)細(xì)胞的凋亡。同時(shí)，建立裸鼠移植瘤模型，通過(guò)常規(guī)HE染色、HIF-1α、CD34免疫組化觀(guān)察HIF-1α基因沉默后對(duì)骨肉瘤體內(nèi)治療效果。 結(jié)果:靶向缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α的短發(fā)夾狀小干擾RNA能夠顯著降低骨肉瘤細(xì)胞的增殖活性和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)顯示轉(zhuǎn)染組腫瘤生長(zhǎng)減慢，腫瘤組織中可見(jiàn)大量壞死組織。瘤組織HIF-1α蛋白表達(dá)降低，微血管密度顯著低于對(duì)