烏魯木齊縣2-14歲人群HBV病毒株變異及OBI生物標志物研究.pdf

1、目的:探討中、小學生(7-14歲)及學齡前兒童（2-6歲）乙型肝炎病毒隱匿性感染(occult hepatitis B virus infection OBI)后S基因片段變異位點與OBI發(fā)生的關系;4種miRNA表達譜與OBI發(fā)生的關聯(lián)性;初步探討miRNA用于早期診斷OBI的可行性。
　　方法:用整群抽樣方法選擇烏魯木齊縣4所中、小學綜合性學校，對在校的學生采用酶聯(lián)免疫試劑法(ELISA)和化學發(fā)光法進行乙肝HBsAg、抗-H

2、Bs兩項血清學指標進行檢測，對檢測發(fā)現的HBsAg和抗-HBs2項指標均為陰性的469名中、小學生的一份血清用QIAGEN公司的試劑盒提取HBV-DNA產物，利用聚合酶鏈反應(PCR)擴增HBV-DNA S基因片段，對43份有目的條帶的PCR擴增產物進行HBV基因S區(qū)(544bp)序列測定。測序后建立HBV序列數據庫，并用MEGA5軟件將測序結果與NCBI國際核苷酸序列數據庫協(xié)作組（INSDC，原Genbank）收錄的序列進行對比分析，

3、以獲得HBV基因S區(qū)序列的核苷酸變異規(guī)律;基于S區(qū)基因片段的進化模型選擇，測定序列與INSDC收錄的參考序列建立進化樹，確定病毒的基因型，比較其基因型分布的差別，分析產生變異的核苷酸位點。40例序列測定成功的中、小學生按漢族，少數民族（包括漢族、哈族和回族）1∶1匹配，符合匹配條件的有20名學生，這20名學生作為OBI研究對象。在整群抽樣調查后，隨機選取與OBI組年齡、性別和族別相匹配的20名健康學生和20名HBsAg陽性學生作為對照。

4、共計60份血清用QIAGEN公司的試劑盒提取RNA，轉錄為cDNA，繼而進行熒光定量PCR測定4種miRNA的相對表達量。用同樣的方法選擇4所幼兒園，對在園的學齡前兒童采用ELISA進行HBsAg、anti-HBs、HBeAg、anti-HBe和anti-HBc5項檢測，對259例HBsAg陰性血清用Promega公司的試劑盒提取HBV-DNA產物，進行PCR擴增HBV-DNA S基因片段，對發(fā)現的21份目的條帶進行測序。用上述方法獲得

5、核苷酸變異規(guī)律，確定基因型。
　　結果:469份中、小學生血樣標本中用PCR擴增共發(fā)現43份HBV DNA剛性標本。其中，40份測序成功，32例B基因型樣本均為adw2血清型，6例C基因型樣本5例為adrq+血清型，1例為ayw2血清型。2例D基因型樣本均為ayw2血清型。D基因型僅在哈薩克族學生中出現。S基因序列翻譯成對應的氨基酸后分別發(fā)生I110L、S113T、K122R、T126I、F134Y、T143S、K159G和K16

6、0R突變。S基因MHR區(qū)氨基酸變異在性別、民族中的差異均無統(tǒng)計學意義。4種miRNA在健康對照者與HBV感染者和健康對照者與OBI感染者血清中的表達，let-7c，miR-122和miR-150的差異有統(tǒng)計學意義，但miR-23b在血清中的差異無統(tǒng)計學意義。另外，OBI感染者中，let-7c，miR-23b，miR-122和miR-150在漢族和少數民族血清中的差異沒有統(tǒng)計學意義。OBI感染者的血清miRNA表達與S基因MHR區(qū)氨基酸變

7、異次數的相關關系均為負相關。let-7c，miR-122，miR-150和miR-23b與基因序列MHR區(qū)變異的突變次數的相關系數分別為-0.606，-0.902，-0.955和-0.897;P值分別為0.202，0.009，0.003和0.015.miR-122，miR-150，let-7c與S基因MHR區(qū)氨基酸變異次數顯著相關。在血清中表達有差異的3種miRNA區(qū)分OBI感染者和正常對照時，曲線下面積(Area under curv

8、e，AUC)為96.4％(靈敏性:92.6％，特異性:90.8％)。用受試者工作特征(ROC)曲線評價各miRNA時，體現出了一定的診斷價值。259份學齡前兒童血樣共發(fā)現21份HBV DNA陽性標本，均測序成功。其中1例由于存在氨基酸插入，沒有檢測出具體基因型。其余20例樣本均為C基因型，其血清型均為adrq+亞型。S基因序列翻譯成氨基酸后分別發(fā)生I110L、S123T、T124S、T126I、T131N、F134Y和P142H突變。1