CD9基因表達(dá)的變異對膀胱移行細(xì)胞癌生物學(xué)特性影響的研究.pdf

1、惡性腫瘤嚴(yán)重威脅人類生命。浸潤和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤致死的主要原因，也是其不同于良性腫瘤的主要生物學(xué)特征。臨床上許多患者常死于常規(guī)治療無效的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。因此，惡性腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移一直是腫瘤學(xué)研究的熱點和難點之一。 膀胱移行細(xì)胞癌是泌尿外科最常見的惡性腫瘤，其生物學(xué)行為具有多樣性和復(fù)雜性的特點，天津泌尿外科研究所暢繼武教授利用分子生物學(xué)技術(shù)對膀胱移行上皮癌研究后，提出了膀胱移行上皮癌可分為Ⅰ類癌(低惡性)和Ⅱ類癌(高惡性)兩類。近年來圍

2、繞膀胱癌在分子生物學(xué)、腫瘤免疫等方面進(jìn)行大量研究，試圖揭示其不同的生物學(xué)行為機(jī)制：1.尋找更加可靠的分子水平的生物學(xué)標(biāo)記物，做到早期診斷、及時準(zhǔn)確的估計患者預(yù)后。2.探索膀胱癌浸潤轉(zhuǎn)移機(jī)制，采用針對性的個性化治療方案，能提高治療效果和遠(yuǎn)期生存率。 近來，一個新的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因膜運(yùn)動相關(guān)蛋白-1(CD9/MRP-1)被發(fā)現(xiàn)與多種腫瘤有關(guān)。腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因亦稱抗腫瘤轉(zhuǎn)移基因，是近年來隨著分子克隆技術(shù)的發(fā)展而認(rèn)識和提出的一類與腫瘤有

3、關(guān)的基因。由于此類基因在非轉(zhuǎn)移腫瘤中呈高表達(dá)，而在轉(zhuǎn)移腫瘤中低表達(dá)，故認(rèn)為其與抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移作用有關(guān)而得名。CD9是一種細(xì)胞粘附分子，屬于四跨膜素超家族(TM4SF)，在泌尿系上皮源性細(xì)胞中有表達(dá)。目前已證實TM4SF與細(xì)胞表面許多分子有關(guān)聯(lián)，其中包括整合蛋白β，膜前體——肝素結(jié)合生長因子(HB-EGF)，HLA-DR主要組織相容復(fù)合物(MHC)等。有學(xué)說認(rèn)為以TM4SF為核心組成細(xì)胞表面分子間相互作用的網(wǎng)絡(luò)，稱之為四跨膜素網(wǎng)絡(luò)。我們推

4、測TM4SF蛋白通過調(diào)節(jié)整合素的功能，從而影響細(xì)胞的粘附，并影響整合素介導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)移，從而影響腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移。另外，TM4SF蛋白本身也具有調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附的作用。 不少學(xué)者分別從不同角度，對全身多種類型的腫瘤與CD9的關(guān)系進(jìn)行研究。結(jié)果表明，CD9在腫瘤中的表達(dá)情況與腫瘤分級、分期、有無轉(zhuǎn)移等情況負(fù)相關(guān)，即CD9高表達(dá)，往往對應(yīng)病理低分級和臨床早期癌，一般無轉(zhuǎn)移；CD9表達(dá)減少或缺失，多見于病理高分級癌，臨床晚期癌，常伴有轉(zhuǎn)移。

5、 研究推測，在高惡性膀胱移行細(xì)胞癌中，CD9表達(dá)減少或缺失可能伴隨CD9基因的突變，可能是膀胱癌發(fā)生發(fā)展的新的機(jī)制，為膀胱癌Ⅱ類癌提供了分子學(xué)標(biāo)志，同時它有可能成為新的治療靶點。 實驗?zāi)康模簽榱诉M(jìn)一步深入研究膀胱移行上皮癌兩類癌在基因水平的發(fā)生機(jī)理及影響機(jī)制，本試驗先采用免疫組織化學(xué)(PowerVision兩步法)的方法，檢測CD9和MMP-2(作為對照)在正常膀胱粘膜和膀胱移行細(xì)胞癌中的表達(dá)情況和相互關(guān)系，然后利用分子

6、生物學(xué)技術(shù)(RT-PCR及基因測序)進(jìn)一步探討CD9基因的突變在其中的作用價值。初步判斷CD9對膀胱移行細(xì)胞癌發(fā)展、侵潤和轉(zhuǎn)移過程的影響及其預(yù)后價值，上述工作對于以CD9為靶點治療腫瘤的后續(xù)研究工作有一定意義。 實驗方法： 實驗一：隨機(jī)選取52例膀胱移行細(xì)胞癌標(biāo)本和10例正常膀胱粘膜標(biāo)本的石蠟切片，采用免疫組織化學(xué)(PowerVision兩步法)的方法檢測CD9和MMP-2在正常膀胱粘膜和膀胱移行細(xì)胞癌之間以及膀胱癌不同

7、分級、分期之間的表達(dá)情況，統(tǒng)計方法分別采用Fisher確切概率法、R×C列聯(lián)表x2檢驗；兩種指標(biāo)表達(dá)的相關(guān)性研究用Spearman等級相關(guān)分析。采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。P＜0.05(雙側(cè))為統(tǒng)計學(xué)顯著水平。 實驗二：選取15例新鮮的膀胱腫瘤組織標(biāo)本(均為膀胱全切，Ⅲ級癌)，均行冰凍切片的免疫組織化學(xué)方法檢測CD9的表達(dá)情況。從中選取CD9表達(dá)弱陽性及陰性者共11例提取其mRNA，并用RT-PCR(一步法)的方

8、法獲得其cDNA序列，然后應(yīng)用DNA測序的方法判斷CD9基因有無突變，再利用生物信息學(xué)的技術(shù)判斷其編碼氨基酸有無改變，所產(chǎn)生蛋白是否具有免疫原性。實驗結(jié)果： 實驗一：結(jié)果顯示，在膀胱移行細(xì)胞癌組織中，CD9的陽性表達(dá)率為78.10％，顯著低于正常粘膜(陽性率為100％)。在病理分級和臨床分期中的表達(dá)差別均具有顯著性，隨病理分級和臨床分期的增高表達(dá)呈減弱趨勢。在膀胱癌中MMP-2的表達(dá)陽性率是67.3％，顯著高于正常粘膜。MMP-

9、2的表達(dá)隨分級、分期的增高呈現(xiàn)出增強(qiáng)的趨勢，CD9的表達(dá)和MMP-2的表達(dá)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性。 實驗二： 冰凍切片的免疫組織化學(xué)染色方法同樣顯示CD9在高惡性膀胱移行細(xì)胞癌中的表達(dá)明顯減弱，26.6％(4/15)陽性，26.6％(4/15)減弱，46.8％(7/15)陰性?；驕y序顯示在高惡性膀胱移行細(xì)胞癌中CD9基因存在2點突變：在第298位堿基處，C→T；在第554位堿基處，A→T；而且在第554位堿基處的突變導(dǎo)致編碼氨基

10、酸的改變，在CD9編碼的228個氨基酸中，第148位氨基酸由酪氨酸(Tyr，Y)→苯丙氨酸(Phe，F(xiàn))。而在第143-188位氨基酸間的肽鏈具有較強(qiáng)抗原性，提示CD9基因存在的突變導(dǎo)致其表達(dá)的蛋白發(fā)生了免疫原性的改變。 結(jié)論：在膀胱移行細(xì)胞癌組織中，CD9的陽性表達(dá)率顯著低于正常粘膜，在病理分級和臨床分期中的表達(dá)差別均具有顯著性，隨病理分級和臨床分期的增高表達(dá)呈減弱趨勢。在高惡性膀胱移行細(xì)胞癌中，CD9基因存在的突變可能是膀胱