浙江省漢族人群耳聾相關12S rRNA和GJB2基因變異的臨床分析和功能研究.pdf

1、本課題將線粒體12S rRNA和GJB2基因作為切入點，對已經建立的浙江省聾病資源庫進行分析，了解非綜合征型耳聾相關基因常見的突變方式、臨床表現，并通過功能實驗研究發(fā)現新的突變位點，從細胞功能學的角度對耳聾相關基因突變的分子機制進行探討。
　　前期工作和基礎實驗
　　此部分主要介紹在已有的浙江省聾病資源霹的基礎上，對其進行的進一步擴增和補充，目前已收集到非綜合征型耳聾病例2953例。完善已收集到的受試者和家庭成員的基本資料，

2、包括聽力學及臨床資料，家系譜圖表等（以調查表的形式），并在他們的外周血標本中提取DNA，并進行線粒體全基因組序列測序，向受試者和家庭成員反饋基因檢測結果報告單。對有重大研究意義的家系，建立永生化類淋巴母細胞系，并凍存和復蘇。為今后科研及臨床工作奠定良好的基礎，為中國聾病遺傳資源的保存做出貢獻，并向最終能夠實現耳聾早期的診斷、干預和治療邁出扎實的一步，最終降低先天性及藥物敏感性聽力損害的發(fā)病率。
　　第一部分221例攜帶GJB2基因

3、突變的非綜合征型耳聾先證者及家系成員基因型與聽力損失程度的相關分析
　　目的:調查分析非綜合征型耳聾患者GJB2基因突變中基因表現型與臨床表現的相關性。方法:2006年4月至2012年9月期間，在溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院耳鼻咽喉科門診篩查出221例帶有GJB2基因突變的非綜合征型耳聾先證者和家庭成員，分別根據GJB2突變對其蛋白產物的影響和是否攜帶235delC分類進行分組，并對其臨床資料進行整理和分析。結果:與235delC復合

4、-雜合突變和非235delC突變的患者相比，含有235delC的純合突變患者出現更為嚴重的聽力損失表現;當把GJB2基因突變分為截斷突變（即終止突變、框移突變）和非截斷突變（即錯義突變）時，截斷突變患者(235delC、299delAT)的聽力損失程度更重;G109A/-突變基因型所引起的聽力損失程度顯著低于參照組235delC/235delC基因型（中位數PTA值為73dB，P＜0.01）。結論:本研究通過系統(tǒng)性分析證明了不同GJB2

5、基因型對聽力損失程度的影響，并篩選出溫和基因型。同時，可以將此研究方法推廣到其他耳聾基因上，從而建立完整的耳聾基因型與臨床表型相關性分析表。此數據為日后在臨床上應用于對GJB2基因突變相關聽力損失患者的預后評估提供了參考依據。
　　第二部分非綜合征型聽力損失相關的線粒體12s rRNA A839G基因突變的功能研究
　　目的:探討線粒體12s rRNA上A839G基因突變與非綜合征型聽力損失的相關性。方法:根據臨床表現、線粒

6、體DNA全序列測序結果，尋找并確定含有線粒體12s rRNA A839G基因突變的先證者，并對其家系成員進行拓展篩查，采集確診家系的外周靜脈血標本，并將血液中的淋巴細胞轉化為永生化類淋巴母細胞系，經過一段時間的細胞培養(yǎng)后進行細胞倍增實驗、藥敏實驗、細胞氧耗率實驗、線粒體膜電位測試和細胞內活性氧檢測(ROS)等一系列基于細胞功能水平上的實驗來探究A839G基因突變與非綜合征型聽力損失的相關性。結果:線粒體DNA全序擴增檢測確定含有線粒體1

7、2s rRNAA839G基因突變的先證者和家庭成員，進一步的種系發(fā)生學分析發(fā)現839位點的保守性指數(CI)高達78.6％;在RPMI-半乳糖培養(yǎng)基中，含有A839G基因突變的細胞株倍增時間顯著長于對照組，且差異有統(tǒng)計學意義(P=0.033);氨基糖甙類抗生素對含有A839G基因突變細胞株的影響并不明顯;含有A839G基因突變細胞株與對照組相比均表現出細胞氧耗率的降低，且在統(tǒng)計學上有顯著性差異(P=0.033);與對照組相比，含有A83

8、9G基因突變細胞株ROS水平均出現較大幅度的升高，且在統(tǒng)計學上有顯著性差異(P＜0.01); A839G基因突變細胞株中線粒體膜電位降低細胞群的數量顯著多于對照組。結論:本研究通過系統(tǒng)性的實驗從細胞水平證明了線粒體12s rRNA A839G基因突變對細胞內線粒體呼吸鏈的功能產生影響，使突變的細胞株的生長速率明顯降低，出現聽力下降的臨床表現。下一步的研究可以從蛋白質組學相關實驗著手來進一步探討線粒體12s rRNA A839G對與呼吸鏈