中國(guó)漢族人群Anderson Fabry病基因突變的研究.pdf

1、目的：1利用分子生物學(xué)技術(shù)在既往被診斷為肥厚型心肌病的患者中篩選Anderson Fabry病患者，從而分析該病被誤診為肥厚型心肌病的情況；2篩選該病的致病突變：3通過與國(guó)外相關(guān)資料相比較，探討中國(guó)漢族人群與國(guó)外患者的發(fā)病率的差異；4對(duì)基因型與臨床表型之間的關(guān)系進(jìn)行分析，探討兩者之間的聯(lián)系；5建立一種在基因水平上對(duì)Anderson Fabry患者進(jìn)行臨床前期診斷的方法。 方法：1．臨床收集的102例既往診斷為肥厚型心肌病

2、的患者(均為山東大學(xué)齊魯醫(yī)院門診及住院患者)，在知情同意的的前提下抽取外周靜脈血約2mL，提取白細(xì)胞，利用酚一氯仿法抽提基因組DNA，另選100名健康志愿者作為正常對(duì)照； 2．聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增GLA基因相應(yīng)的七個(gè)外顯子，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5％瓊脂糖凝膠電泳以了解擴(kuò)增的效率及特異性；3．利用單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(Single strand conformationpolymor

3、phism，SSCP)分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，處理后的產(chǎn)物行8％及10％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染法顯色觀察結(jié)果；4．根據(jù)同一塊膠上電泳條帶遷移率的差異判斷是否有陽性結(jié)果，出現(xiàn)異常條帶者擴(kuò)增其全部外顯子及相鄰的部分內(nèi)含子序列，應(yīng)用低熔點(diǎn)膠回收后送公司測(cè)序；5．對(duì)基因突變陽性者進(jìn)行家系調(diào)查，并對(duì)突變陽性家族成員檢測(cè)a-半乳糖苷酶活性；6分析基因?qū)W改變與臨床表型之間的關(guān)系。 結(jié)果：1．成功地對(duì)102例肥厚型心肌病患者及100例正常

4、對(duì)照者的GLA基因的七對(duì)外顯子進(jìn)行了PCR擴(kuò)增； 2．全部擴(kuò)增產(chǎn)物均經(jīng)過兩種條件下的單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(SSCP)進(jìn)行基因突變的篩選，通過反應(yīng)條件的調(diào)整，每一個(gè)PCR產(chǎn)物均形成清晰的單鏈條帶，與正常人相應(yīng)的單鏈帶進(jìn)行了比較分析； 3．三例患者的SSCP分析出現(xiàn)異常條帶，經(jīng)測(cè)序發(fā)現(xiàn)均為點(diǎn)突變。其中一例患者的第1168位(EMBL X14448.1)G突變?yōu)锳/G雜合;一例患者第1170位G突變?yōu)锳；最后一例患者的第1194位C突變?yōu)門

5、/C雜合。前兩種突變導(dǎo)致了mRNA5’非蛋白質(zhì)編碼區(qū)的序列改變，最后一種為a一半乳糖苷酶信號(hào)肽的同義突變。4.分析顯示G1170A．突變攜帶者a-半乳糖苷酶活性明顯降低，在其家族成員中未能發(fā)現(xiàn)該致病突變；而1168位雜合突變患者的家系分析顯示其母親及兩個(gè)女兒均攜帶該種突變，但其酶活性降低不一，癥狀亦較輕。 結(jié)論：1在本研究中，我們共篩選出兩種新的致病突變位點(diǎn)。現(xiàn)今已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了300余種Fabry致病突變，但是由于GLA基因mRNA

6、5’端非蛋白質(zhì)編碼區(qū)突變而導(dǎo)致該病尚為首次報(bào)道。2中國(guó)漢族人群Anerson Fabry病的發(fā)病率可能高于國(guó)外相應(yīng)報(bào)道。3基因型與表現(xiàn)型的關(guān)系的分析顯示，不能簡(jiǎn)單的由基因型來推導(dǎo)臨床表型，反之亦然。4 PCR-SSCP銀染技術(shù)對(duì)于Anderson Fabry病基因突變的檢測(cè)是適宜的，并可以進(jìn)行推廣。5在臨床實(shí)踐中，Anderson Fabry病患者易被誤診為肥厚型心肌病，因而我們對(duì)于超聲檢查呈現(xiàn)非對(duì)稱性室間隔肥厚的患者應(yīng)該加大警惕，考慮